eHsp90α的单克隆抗体1G6-D7对博来霉素诱导肺纤维化的作用及机制研究

发布时间：2020-04-15 10:11

【摘要】：研究背景及研究目的:肺纤维化是一种病因不明的弥漫性肺病,其预后差,发病率增长迅速。其机制尚不清楚,寻找更安全的防治靶点仍是难题。上皮细胞受损、持续炎症反应、肺成纤维细胞过度活化和迁移、胶原的病理性沉积是肺纤维化的重要进程。其中,肺成纤维细胞功能的改变是其发生机制的研究热点。热休克蛋白90(Heat Shock Protein90,Hsp90)参与组织损伤与修复,Hsp90抑制剂可改善多种器官纤维化,但其严重的副作用影响临床应用。近年来发现,Hsp90的另一种表型,分泌型Hsp90α(eHsp90α)细胞在各种刺激下被分泌到细胞外,其与LRP-1受体结合促进伤口愈合、肿瘤侵袭和转化。但eHsp90α在肺纤维化中作用鲜有报道。本课题组具备eHsp90α的单克隆抗体1G6-D7。因此,我们旨在通过动物和细胞实验探索:1.eHsp90α在肺纤维化中表达、作用和机制;2.1G6-D7能否改善肺纤维化,并初步探索其作用机制。方法:1.动物实验1.1 C57BL/6 小鼠分为 Control(Ctrl)组、BLM 组、1G6-D7 组、1G6-D7+BLM组。BLM组、1G6-D7+BLM组小鼠气管内注射BLM,Ctrl组注射等量生理盐水;1G6-D7+BLM组、1G6-D7组滴鼻吸入1G6-D7,连续5天/周,共3周。收集血清及肺泡灌洗液,Elisa检测血清eHsp90α,肺泡灌洗液eHsp90α、IL-6、IL-4、INF-γ;肺组织行HE及Masson染色,免疫组化检测α-SMA、collagen I,Western Blot 检测 α-SMA、collagen I、LRP-1、p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-P38/P38。2.细胞实验应用含有10%胎牛血清的F-12K培养基对人肺成纤维细胞HFL-1进行培养,实验分为 ctrl 组、1G6-D7 组、TGF-β1 组、1G6-D7+TGF-β1 组。收集 TGF-β1 刺激HFL-1后的培养上清,浓缩后检测eHsp90α;Western Blot检测α-SMA、collagen I、LRP-1、p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-P38/P38。结果:1.肺纤维化小鼠及TGF-β1的HFL-1细胞eHsp90α增加:BLM肺纤维化小鼠肺泡灌洗液及血清eHsp90α明显增高。TGF-β1可诱导HFL-1的培养上清中eHsp90α 增加。2.1G6-D7改善BLM所致的肺部结构破坏及胶原沉积:病理染色显示1G6-D7可改善BLM所致肺泡间隔增厚和结构破坏,减轻炎症细胞浸润、抑制成纤维母细胞灶形成和胶原增生沉积。免疫组化显示BLM使小鼠肺部表达α-SMA、collagenI阳性的细胞明显增加;WesternBlot发现TGF-β1使HFL-1细胞表达α-SMA、collagen I 增加。而 1G6-D7 处理可抑制 α-SMA、collagen I 的表达。3.1G6-D7部分纠正BLM肺纤维化小鼠肺部炎症因子紊乱:BLM肺纤维化小鼠的肺泡灌洗液中IL-6和IL-4增高,1G6-D7处理可抑制此反应。然而,BLM使纤维化小鼠肺泡灌洗液中INF-γ减少,1G6-D7滴鼻治疗可使INF-γ的表达部分恢复。4.1G6-D7调节肺纤维化信号分子的活性:BLM肺纤维化小鼠的肺组织及TGF-β1 诱导的 HFL-1 细胞中 LRP-1、p-Akt、p-ERK、p-P38 高表达,能被 1G6-D7有效抑制。结论:1.eHsp90α可能促进肺成纤维细胞的活化和胶原合成分泌参与肺纤维化的发生发展。2.1G6-D7可改善BLM诱发的小鼠肺纤维化,其机制可能是通过抑制eHsp90α激活LRP-1受体及下游Akt/ERK/P38等信号通路,减少肺成纤维细胞活化及细胞外基质合成。
【图文】：

动物模型,肺泡灌洗液,血清

ｇ邋８逦■逦0邋２００邋ｔ邋■—逡逑Ｉ逦Ｍｉｌｌ逡逑ｉ邋＾邋＾ｌｉｉ逦１邋５0邋１１１１逡逑图１肺纤维动物模型中ｅＨｓｐ９０ａ的表达。图１Ａ：肺泡灌洗液ｅＨｓｐ９０ａ，ｎ＝６邋（＊尸＜０．０５，对逡逑比邋Ｃｔｒｌ邋组；＃尸＜０．０５，对比邋ＢＬＭ邋组）；图邋１Ｂ：血清邋ｅＨｓｐ９０ａ，邋ｎ＝６邋（＊邋Ｐ＜０．０５，对比邋Ｃｔｒｌ逡逑组；＃户＜０．０５，对比ＢＬＭ组）逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋Ｈｓｐ９０ａ邋ｉｎ邋ＢＬＭ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｐｕｌｍｏｎａｒｙ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｍｉｃｅ邋ｍｏｄｅｌ．逡逑Ｆｉｇ．邋］邋Ａ：邋Ｅｌｉｓａ邋ｏｆ邋ＢＡＬＦ邋ｅＨｓｐ９０ａ，邋ｎ＝６邋（＊邋户＜０．０５，邋ｖｓ邋Ｃｔｒｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＃尸邋＜０．０５，邋ｖｓ邋ＢＬＭ邋ｇｒｏｕｐ）；邋Ｆｉｇ．】Ｂ：逡逑Ｅｌｉｓａ邋ｏｆ邋ｓｅｒｕｍ邋ｅＨｓｐ９０ａ，邋ｎ＝６邋（＊邋Ｐ＜０．０５，邋ｖｓ邋Ｃｔｒｌ邋ｇｒｏｕｐ；ｕ邋Ｐ邋＜０．０５，邋ｖｓ邋ＢＬＭ邋ｇｒｏｕｐ）逡逑２０逡逑

肺纤维化,肺部炎症,小鼠

图４逦１Ｇ６－Ｄ７对肺纤维化小鼠肺部炎症因子的影响，ｎ＝６邋（＊尸＜０．０５，对比Ｃｔｒｌ组，Ｐ＜０．０５，逡逑对比ＢＬＭ组）逡逑Ｆｉｇ．４邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋１Ｇ６－Ｄ７邋ｏｎ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ｉｎ邋ｐｕｌｍｏｎａｒｙ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｍｉｃｅ，邋ｎ＝６邋（＊邋尸＜０．０５，逡逑ｖｓ邋Ｃｔｒｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＜０．０５，邋ｖｓ邋ＢＬＭ邋ｇｒｏｕｐ）逡逑７．４邋１Ｇ６－Ｄ７对小鼠肺纤维化标志蛋白表达的影响逡逑肺纤维化标志蛋白如ａ－ＳＭＡ及ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ表达变化是肺纤维化的重要特征之逡逑一。我们同时应用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ及免疫组化的方法检测小鼠肺部纤维化标志蛋白逡逑的表达，重点观察１Ｇ６－Ｄ７对ｃｔ－ＳＭＡ及ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ表达的影响。免疫组化的结果显逡逑示，单纯滴鼻给予１Ｇ６－Ｄ７并不影响ａ－ＳＭＡ及ｃｏｌｌａｇｅｎｌ的表达（棕色），而单次气逡逑管内给予ＢＬＭ便可明显诱导肺成纤维细胞及肺泡上皮细胞表达ａ－ＳＭＡ、ｃｏｌｌａｇｅｎ逡逑Ｉ增加，细胞夕卜ｃｏｌｌａｇｅｎ他显著增加。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ结果也同样显示，，单纯１Ｇ６－逡逑Ｄ７组标志蛋白的表达对比Ｃｔｒｌ组无明显变化，而ＢＬＭ组小鼠肺部ａ－ＳＭＡ及逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563

【相似文献】