海水淹溺兔肺泡巨噬细胞TNF-α mRNA的动态表达及地塞米松干预作用

发布时间：2020-04-15 14:09

【摘要】： 海水淹溺(Sea water drowning)不仅常发生于航海事故、海上作业、海上旅行等,而且是军队海上训练和作战减员的重要原因[1]。海水淹溺可导致急性肺损伤(acute lung injury,ALI),严重者可发展为海水型呼吸窘迫综合征(sea water respiratory distress syndrome, SW-RDS),病情严重,救治极为困难[2]。因此,研究海水型ALI的早期救治,并防止其向SW- RDS转化,具有重要的意义。有学者报道地塞米松可以减轻海水淹溺后急性肺损伤,但具体机制尚不明确[3-4]。普遍认为TNF-α是导致ALI/ARDS的启动因子[5-7],而海水淹溺后TNF-αmRNA的动态表达及地塞米松对海水淹溺后巨噬细胞内TNF-α分子表达的影响尚未报道。本研究试图阐明TNF-α在SW-RDS发病机制中的作用,探索地塞米松对海水型ALI的治疗机制。目的:通过向兔气管内灌注海水,模拟海水淹溺后导致ALI生理过程,在灌注后不同时点观察AM内TNF-αmRNA的动态表达,并应用地塞米松(Dexamethasone , Dex)进行干预,探讨地塞米松对海水淹溺急性肺损伤的治疗作用及相应的机制。方法: 1.实验分组健康新西兰大耳兔40只(第四军医大学动物实验中心提供),体重(2.50±0.36)kg。为观察海水淹溺后肺泡巨噬细胞(AM)内TNF-αmRNA的动态表达,25只兔随机分成5组:海水淹溺后0min(正常对照组)、30、60、90、120min时点组;为了解地塞米松对海水淹溺后AM内TNF-αmRNA表达的影响,15只兔随机分为3组(每组5只):①对照组(Control group,C组):仅作气管插管,不作其他处理;②海水淹溺组(Model group,M组):制备动物模型,以等量生理盐水代替地塞米松静脉注射。③地塞米松治疗组(Treatment group,T组):模型建立后立即静脉注射地塞米松2mg/ kg ,随即以(1mg·kg - 1·h - 1)静脉维持。 2.建立海水淹溺家兔急性肺损伤模型 3.动脉血气分析各组均于手术或模型建立后0min、30min、60min、90min、120min经左侧股内动脉采集0.5ml动脉血注入抗凝试管用于动脉血气分析,采血0.6ml,血气分析由第四军医大学唐都医院血气/肺功能室测定。 4.支气管肺泡灌洗液(BALF)的采集:25只时点组兔于上述各时点放血处死,C组、M组、T组于100分钟放血处死,随后开胸、夹闭气管取全肺。左侧肺叶作肺泡灌洗:生理盐水以5 ml/次,共10 ml,回收率70%左右。 5.肺组织的离体观察分别于致伤后0min、30min、60min、90min、120min分批处死家兔,取肺组织,观察肺脏的肉眼变化,并使用数码相机拍照记录。肺组织含水量测定:采用干湿重称重法测定::取得右肺上、中叶,称取肺湿重(W) ,而后置于100℃恒温烤箱内48h至重量恒定后称肺干重(D) ,肺含水量=(肺湿重-肺干重)/肺干重。取左肺下叶组织称重标记,冷冻保存于-70℃环境。测量肿瘤坏死因子a(TNF-a)、IL-10的含量。各组于右下叶同等部位取0.5g肺组织置于10%福尔马林溶液中,固定组织块,经石蜡包埋切片,HE染色后,观察组织病理学改变。 6.肺泡巨噬细胞的分离和培养将支气管肺泡灌洗液1 000 r/min离心10 min,沉淀用D-Hank液洗涤,以RPMI-1640悬浮后,置25 mL玻璃细胞培养瓶中,于37℃、5%二氧化碳、PH 7.2条件下培养4小时,等AM黏附于玻璃表面,再用培养液冲洗掉未黏附的中性粒细胞和淋巴细胞等,分离纯化的AM以瑞氏染色证实为巨噬细胞,纯度95%,台盼蓝染色鉴定细胞活力90%。 7.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔肺泡巨噬细胞内TNF-a mRNA表达结果 (1)血气分析结果显示, PE-SWD模型建立后, 60min时, PaO2降低到到最低点(31.6±4.98mmHg, 1mmHg=0.133 kPa)后逐渐升高,到120分钟再次降低;PCO2在30min升至最高点,后逐渐回复,可能与家兔代偿性过度通气有关;PH值和D/W在模型建立后进行性下降。 (2)病理学检查结果显示:大体标本可见海水淹溺后双肺表面散在暗红色片状区及点状出血区,以双下肺背侧为主,呈“红色肝样变”,肺组织切面及气管腔内有中量血性粉红色泡沫样液体渗出。以地塞米松治疗后的T组亦可见基本相同的肺损伤区域,但总体颜色较淡。HE染色(×100倍)下,M组可见肺泡及肺间质水肿明显,肺出血、肺泡隔断裂,肺泡腔及微血管中大量炎症细胞(主要为中性粒细胞)浸润,肺损伤程度严重;而T组肺泡扩张、水肿明显,肺泡腔及间质内炎症细胞浸润较轻,肺损伤程度较M组减轻。 (3) RT-PCR方法检测海水淹溺后家兔AM内TNF-αmRNA的表达即开始上升,随时间增加逐渐增高.90分钟左右达到高峰,之后轻微下降,但仍明显高于正常对照组(P0.01)。C组AM中TNF-αmRNA仅有轻微表达,M组显著升高(P0.01):T组显著低于M组(P0.05)。结论: 1.本实验结果表明兔PO2、PH进行性下降,提示肺换气功能受损严重,符合ALI/ARDS诊断标准,表明海水淹溺致急性肺损伤兔模型构建成功。 2. SW-RDS家兔肺泡巨噬细胞中TNF-a mRNA的表达水平在模型建立后即开始升高(P0.01),说明SW-RDS原因可能与肺泡巨噬细胞内TNF-αmRNA高表达有关;对SW-RDS动物模型AM中TNF-αmRNA的动态分析,提示急性肺损伤时TNF-a mRNA主要在肺泡巨噬细胞内表达,且与急性肺损伤程度相关。 3.本实验以地塞米松治疗患SW-RDS的家兔后,病理结果显示T组兔肺水肿情况较M组轻微而且回复较快,同时T组AM中TNF-αmRNA显著低于M组,说明地塞米松可降低海水淹溺兔急性肺损伤肺泡巨噬细胞TNF-αmRNA的高表达,减轻PE-SWD肺损伤程度,达到对急性肺损伤的治疗。
【图文】：

密度分析,肺泡巨噬细胞,家兔,淹溺

模型建立后TNF-α mRNA的表达即开始上升,随时间增加逐渐增高.90分钟左右达到高峰,之后轻微下降,但仍明显高于正常对照组(P<0.01),见图1。（A）（B）0min 30min 60min 90min 120min MARK图1：海水淹溺后家兔肺泡巨噬细胞内TNF-a mRNA的动态表达注：（A）运用Gel-Proanalyzer version 3.0半定量密度分析结果表明,正常对照组TNF-α mRNA的扩增片段仅有微量表达,其值为(0.142 ±0.056); 淹溺后30 、60 、90 、120min 显著高于正常对照组( P < 0. 01) ,淹溺后90min 达到高峰(1.204 ±0.130) ,之后稍有下降,可能与体内分泌抗炎因子有关[5,6]。（B）琼脂糖电泳分析海水淹溺后不同时间TNF-a mRNA的表达。电泳结果显示各组在淹溺不同时间367bp处均可见强弱一致的扩增带,此为β-actin mRNA 扩增条带；在267bp 处有强弱不同
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R649.3;R563.8

【参考文献】