哮喘大鼠肺泡巨噬细胞膜钾通道活性及分泌功能的研究

发布时间：2020-04-16 02:04

【摘要】： 目的 支气管哮喘是一种由多种细胞,包括炎性细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞和肺泡巨噬细胞等)、气道结构细胞(气道平滑肌细胞和上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。虽然已开展了较多关于哮喘的研究与治疗工作,但由于哮喘的发病机制始终未得到完全阐明,因此,目前哮喘仍是无法治愈的疾病之一。 肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)是定居在肺泡和气道表面的重要免疫效应细胞,可以激活炎症反应消除入侵者。但是,过度的炎症反应可以干扰气体交换。这就意味着AM有两方面相反的作用-即保护机体免受侵害和增强炎症反应的作用。有研究显示,AM占支气管肺泡灌洗液(bronchus alveolar lavage fluid,BALF)中细胞总数的90%以上,但其在哮喘发病中的作用至今不是十分清楚。本实验研究哮喘大鼠AM钾通道活性的变化情况及其生成各种炎症因子的变化从而分析AM在哮喘时功能状态的变化及其可能的调控机制。 实验方法 首先利用卵蛋白(ovialbumin,OVA)致敏并激发大鼠建立哮喘模型,对照组则用生理盐水代替;HE染色观察哮喘大鼠的病理学变化情况;末次激发后24小时将大鼠麻醉,进行气管插管,用冷的PBS进行支气管肺泡灌洗,每次10ml,重复五次,收集BALF,回收率可达90%以上,分离并培养AM。利用全细胞电压钳模式记录AM细胞膜上的电压依赖性钾通道(Voltage-dependent potassium channel,K_v)电流,观察比较哮喘模型组和对照组K_v通道活性的变化;两组细胞在利用LPS(5ug/ml)处理12小时前后,通过RT-PCR及Western blot方法检测肺泡巨噬细胞中IL-6和TNF-α的转录及表达水平;利用大鼠ELISA检测试剂盒检测LPS(5ug/ml)处理12小时前后肺泡巨噬细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的分泌水平。 实验结果 1、AM细胞膜Kv电流变化:病理学检测发现哮喘模型组炎症细胞浸润明显增加,有大量红细胞渗出,气道平滑肌明显增厚,管腔内可见粘液栓;哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数显著增高,与对照组比较差异显著(P＜0.01),但AM百分比无明显差异(P＞0.05);应用Kv通道特异性阻断剂4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)后电流幅度明显降低,证实检测到的AM细胞膜上的电流为Kv电流;哮喘大鼠AM细胞Kv电流密度为[(32.65±18.82)pA/pF,n=11]较对照组[(87.57±33.14)pA/pF,n=11]明显降低(P＜0.01)。 2、AM分泌IL-6、TNF-α等细胞因子的变化:LPS处理前后哮喘组AM转录、表达IL-6和TNF-α的水平与对照组相比均明显增高(P＜0.05);LPS处理之前哮喘组AM分泌IL-6和TNF-α水平与对照组相比显著增高(P＜0.01),LPS处理可使哮喘组与对照组的AM分泌IL-6和TNF-α水平均明显增高(P＜0.01),但使对照组AM分泌IL-6和TNF-α的水平升高更为明显,从而使哮喘组AM分泌IL-6和TNF-α水平与对照组无显著性差异(P＞0.05)。 结论 1、哮喘大鼠AM细胞膜上Kv通道电流密度降低,活性减小。 2、哮喘大鼠AM分泌TNF-α、IL-6水平显著增高,LPS处理使AM分泌TNF-α、IL-6作用增强,但对正常AM作用更为明显。
【图文】：

AM细胞膜上Kv电流的鉴定

4、哮喘大鼠AM细胞膜上Kv电流的变化哮喘模型组AM细胞Kv电流峰值明显低于对照组(见图3)。 +5omV时方波刺激所得的模型组Kv电流密度(见图3A)[(32.65士 18.82)pA/pF，n=川较对照组(见图3B)〔 (87.57士33.14)p刀pF，n一川明显降低(P<0.01);其电流电压之间的关系(见图3C)所示。B+somv~羹啊匕5肠ms1(pA)V(mV)I一V曲夔戈图3，大鼠AM细胞膜Kv电流的比较(mean士SD，n=11)A:正常对照组大鼠AM细胞膜上的Kv电流实测图;B:哮喘组大鼠AM细胞膜上的Kv电流实测图;C两组大鼠AM细胞膜上相应的Kv电流一电压曲线。5、LPs处理前后TNF一a的转录水平变化对照组AM用LPS激活前TNF一a转录水平为(0.17士0.04)与LPS处理之后的(0.64士0.32)相比，差异具有显著性(P<0.05，，n二5)。模型组AM用LPS处理后其TNF一a的转录水平由 (0.58士0.20)增加到 (l.02士0.10)，具有显著性差异(尸<0.05
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R562.25

【参考文献】

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本文编号：2629268