环介导等温扩增技术在下呼吸道感染病原菌诊断上的应用

发布时间：2020-04-20 18:42

【摘要】： 目的:建立一种运用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测和鉴定常见下呼吸道感染病原菌的方法,以提高临床检测病原菌的速度及准确性。证实其在诊断上的应用价值。 方法:1.确定常见下呼吸道感染11种病原菌:肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体;2.通过BLAST、Align X和Primer 5.0程序,对各病原菌菌株的基因保守区进行序列分析,设计并合成本试验所需的引物;3.收集我院诊断为下呼吸道感染的50例患者痰标本;3.提取各标本中病原体DNA;4.将提取的DNA进行环介导等温扩增技术扩增,放入实时荧光定量PCR (Real-Time PCR)仪65℃反应45分钟,行荧光方法检测,测定熔解曲线,进行数据分析;5.对检测体系的灵敏度和特异性进行测试;6.利用该检测方法对50例临床诊断为下呼吸道感染的痰标本进行LAMP法检测,与传统的痰常规细菌培养法进行比较分析。 结果:1.病原菌的检测灵敏度均可以达到200copies/25ul反应体系(相当于1.7×104copies/ml痰液);2.每种菌株的引物只与其相应的细菌DNA反应,而与下呼吸道感染常见11种病原菌无交叉反应,表明探针具有较高的特异性;3.LAMP检测的阳性率为82.0%,较常规细菌培养的阳性率高;4.LAMP技术能检测出多数浓度较低的样品细菌或者难培养的细菌。 结论:本研究初步建立的下呼吸道感染病原菌LAMP技术能够准确、敏感、快速、高效地检测痰标本中的病原菌,为进一步完善和建立下呼吸道感染病原菌的LAMP基因芯片检测技术打下了基础。
【图文】：

序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5'-F1c-F2；内引物BIP(backward innerprimer) 包含B1c(B1区域的互补序列)和B2序列，即5'-B1c-B2。外引物为F3和B3序列。如图1所示：图1 靶序列上6个特异区域及引物设计LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段[5]。利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(65℃左右)保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应,扩增出LAMP特征性梯状条带。还可通过设计两条环引物（FL、BL）可使反应速度提升1/2-1/3[6]。环介导等温扩增结果判定主要方法有: (1)电泳。将扩增产物电泳后在紫外灯下观察可见扩增产物呈梯状条带；(2)直接观察扩增管的浊度。研究发现LAMP阳性扩增管反应后形成副产品焦磷酸镁, 而没有发生扩增反应的阴性管中没有副产品焦磷酸镁产生，，因此阳性管的浊度比阴性管高，经高速离心后出现更为明显的白色沉淀，阴性对照管则没有白色沉淀[7]；(3)加入染料直接用肉眼判定结果。可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，在紫外灯或日光下通过肉眼进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之,则保持SYBR Green I的橙色不变[8]。随着LAMP方法的不断发展，目前电泳法已经很少应用。LAMP反应体系的构成和PCR的相似，包含了引物、模板DNA、Bst DNA聚合酶、dNTP和缓冲液。其操作程序简便

4copies/ml痰液）。以肺炎链球菌为例，如图2：45分钟内灵敏度可以达到2E+02copies/25μl；空白对照BC及1号管在45分钟内无假阳性扩增。3.2 LAMP技术的特异性所检测的某一病原菌的特异性与11种下呼吸道感染病原菌及常见的11种病原菌无交叉反应，以肺炎链球菌为例，如图3：
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R56;R450

【引证文献】

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1 陈愉生;王大璇;陈p営

本文编号：2634841