骨髓间充质干细胞在治疗芥子气肺损伤中的损伤修复和免疫调节作用研究

发布时间：2020-04-20 12:07

【摘要】：芥子气(sulfur mustard,SM),是糜烂性毒剂的代表,在第一次世界大战中被首次使用,后又相继在日本侵华战争、两伊战争及叙利亚内战中被使用,造成大量人员中毒甚至死亡。芥子气作用时间长,中毒途径多,穿透性强,且尚无特效的防治措施,所以仍是我军面临的主要化学战剂威胁之一。芥子气是日本遗弃在华的主要化学战剂之一,对我国人民的健康和环境安全构成重大威胁,尤以东北地区最为严重。因此,积极探究芥子气的中毒机制,寻找有效的防治药物,对维持我军战斗力、保障公民健康及保护生态环境均有着重要的战略意义。芥子气可引起体内多脏器的中毒损伤,其中肺是芥子气损伤的主要靶器官。大量研究发现,芥子气中毒后可引起呼吸道的炎症及肺泡结构的破坏,从而引起急性肺损伤导致患者死亡。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类成体干细胞,具有自我更新以及分化的功能。研究表明BMSCs可以通过分泌抗炎性细胞因子、调节免疫细胞分型、分泌生长因子及分化作用等多种途径对损伤组织的修复、免疫系统的调节产生作用,从而减轻肺部炎症反应、加速损伤肺组织的修复,缓解肺损伤。本文研究发现,BMSCs能通过分泌EGF、FGF、PDGF等生长因子,促进I型、II型肺泡上皮细胞增生,加强细胞连接等途径对肺损伤的修复产生影响,从而减轻肺水肿,并对芥子气中毒小鼠肺功能起到改善作用。此外BMSCs还可以通过影响巨噬细胞和T淋巴细胞的分化、调节TLR4信号通路的表达从而显著降低促炎性细胞因子的表达,升高抗炎性细胞因子的表达。一、BMSCs的鉴定及其在芥子气中毒小鼠体内的定位取ICR小鼠股骨和胫骨进行BMSCs的原代分离及培养,通过流式细胞术检测表面标志抗原及干细胞诱导分化实验对所获得的BMSCs进行鉴定:结果显示分离培养获得的细胞可以高表达间质类细胞特异性表面抗原CD73、CD90、CD105,不表达或低表达造血细胞表面抗原CD11b、CD19。透过诱导分化实验发现,获得的BMSCs能成功地分化为成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞。本研究通过将ICR小鼠皮下注射芥子气的方法建立了芥子气染毒的动物模型,将培养扩增鉴定后的BMSCs通过尾静脉注射从而进行下一步实验研究。首先我们通过小动物活体成像的方法明确了BMSCs在芥子气染毒小鼠模型中的定位,发现其主要聚集于双侧肺脏,其中1h和2h荧光强度明显升高,至24h仍有一定的荧光信号,明确了BMSCs可以作用于芥子气损伤后的主要靶器官-肺脏。二、BMSCs对芥子气中毒小鼠肺损伤修复的作用及机制研究本课题组前期研究发现,BMSCs治疗能显著降低芥子气中毒小鼠肺湿/干重比和肺泡灌洗液中总蛋白浓度。为进一步观察损伤修复在BMSCs治疗芥子气肺损伤中的作用,我们通过ELISA法检测了肺组织内生长因子的变化,结果显示BMSCs治疗后可以显著提高芥子气中毒小鼠肺组织内EGF、FGF、PDGF的表达。Ki-67染色结果显示,BMSCs治疗后小鼠肺组织内Ki-67阳性细胞比例与芥子气组相比显著升高。此外,我们还发现芥子气损伤后,肺组织内I型、II型肺泡上皮细胞表面标志蛋白AQP5、SP-C及细胞连接蛋白VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、ZO-1、Caveolin-1均不同程度降低,而BMSCs治疗后AQP5、SP-C、VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、ZO-1、Caveolin-1的表达均显著提高。以上结果提示,BMSCs能通过分泌生长因子、促进受损的肺泡上皮细胞增殖、促进上皮细胞连接的修复及分化成为肺泡上皮细胞等多种途径促进受损肺上皮的修复,从而减轻肺水肿、改善肺功能。前期研究中我们发现BMSCs能显著改善芥子气中毒小鼠生存率的变化,本研究中我们进一步检测了BMSCs对于芥子气中毒小鼠肺功能的影响。结果表明,芥子气中毒后,小鼠最大呼气流速、最大吸气流速、每分钟通气量以及50%肺容积呼气流速与正常组相比明显降低,给予BMSCs治疗后上述指标出现升高,提示BMSCs治疗能在一定程度上改善芥子气中毒小鼠的肺功能。三、BMSCs对芥子气中毒小鼠免疫调节的作用及机制研究本课题组前期研究发现,BMSCs能通过减少趋化因子的产生从而显著降低芥子气中毒小鼠肺组织内巨噬细胞、T淋巴细胞等炎细胞的浸润,因此本研究进一步考察了其对于巨噬细胞及T淋巴细胞分型的变化。结果发现,与芥子气组相比较,BMSCs可以显著降低促炎性M1型巨噬细胞及Th17细胞的表达,升高抗炎性M2型巨噬细胞及Treg细胞的表达。提示BMSCs能通过调节免疫细胞的分型从而减轻芥子气所致肺损伤。为进一步考察免疫调节在BMSCs治疗芥子气肺损伤中的作用,我们检测了小鼠肺组织及细胞模型中TNF-?、IL-1?、IL-6、IL-12、IL-17等促炎因子及IL-10、TGF-?等抗炎因子的表达。结果发现,与芥子气组比较,BMSCs可以显著降低肺组织中TNF-?、IL-1?、IL-6、IL-12、IL-17的表达量,升高IL-10、TGF-?的表达量。在芥子气染毒的小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)及脾淋巴细胞模型中,将其与BMSCs共培养后同样可以显著降低培养上清液中TNF-?、IL-1?、IL-12、IL-17的表达量,升高IL-10、TGF-?的表达量。提示BMSCs能通过降低促炎因子、升高抗炎因子减轻体内炎症反应。我们进一步在动物及细胞水平上探究了可能在BMSCs减轻芥子气损伤中发挥作用的信号通路。结果发现,与正常组相比较,芥子气染毒后小鼠肺组织内TLR4及其及其下游NF-κB p65、p50的表达量明显增高,给予BMSCs治疗可明显降低TLR4、NF-κB p65、p50的表达。在Raw264.7细胞模型中,TLR4、NF-κB p65、p50的表达量同样出现升高,给予BMSCs Transwell共培养、敲除巨噬细胞内TLR4受体或给予TLR4抑制剂TAK242后,TLR4、NF-κB p65、p50的表达量均显著降低。提示TLR4信号通路可能在BMSCs调节芥子气肺损伤的过程中发挥着重要作用。
【图文】：

流式,灰色,阳性率,军医大学

军军医大学硕士学位论文三、实验结果（一）ICR 小鼠 BMSCs 的鉴定1、ICR 小鼠 BMSCs 表面标志物的流式鉴定结果BMSCs 是一类异质性细胞。无特异性的表面标记分子，主要通过多种表面物的标记来检测和纯化。流式检测结果显示，第3代ICR小鼠BMSCs高表达CDD90、CD105，阳性率分别为 96.49%、98.55%、96.53%；而几乎不表达 CD1D19，阳性率分别为 0.73%、0.19%（图 1）。

茜素红,橘红色,诱导分化,脂滴

骨髓间充质干细胞在治疗芥子气肺损伤中的损伤修复和免疫调节作用研究（2）BMSCs 的成骨诱导取 P3 代 BMSCs 进行成骨诱导培养 21d 后，倒置显微镜下可见 BMSCs 变为不规则的多角形，细胞间质内可见大量钙化结节。茜素红染色后呈现红色（图 2-B）。（3）BMSCs 的成软骨诱导取 P3 代 BMSCs 进行成软骨诱导培养 21d 后，，倒置显微镜下可见 BMSCs 细胞内基质糖胺聚糖。甲苯胺蓝染色后为蓝色（图 2-C）。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563

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