IDO基因修饰未成熟DC诱导哮喘免疫耐受的实验研究

发布时间：2020-05-05 14:36

【摘要】： 支气管哮喘(哮喘)是一种由多种炎症细胞参与的慢性气道变应性炎症性疾病,其发病机制尚未完全阐明。“Th1/Th2偏移”假说被认为是哮喘发病的主要免疫学机制,该假说认为Th2细胞的过度活化导致了Th2反应为主的免疫反应,Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的气道炎症发生发展中起关键作用。正常人接触过敏原后不会发生Th2细胞的过度活化,这是因为正常人可以对过敏原产生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷导致接触过敏原后T细胞异常活化,增殖和分化为Th2细胞,引起“Th1/Th2偏移”,始动哮喘的气道炎症。 吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase ,IDO)是色氨酸分解代谢的限速酶,可形成局部低色氨酸环境[6],抑制活化的CD4~+T细胞增殖,诱导免疫耐受。树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前已知功能最强大的抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC),它既是气道变应性炎症的始动因素,也可能是介导免疫耐受的枢纽环节,在激发免疫反应和诱导免疫耐受两方面均起关键作用[7-10]。 本研究应用pEGFP-N1-IDO基因真核表达载体转染未成熟DC,并观察IDO基因对卵蛋白致敏/激发小鼠模型CD4~+T细胞的影响;将pEGFP-N1-IDO基因真核表达载体转染未成熟DC移入卵蛋白致敏/激发小鼠气道,观察对其气道炎症的影响,为临床防治哮喘提供新的思路。 研究内容和方法: 1.小鼠IDO基因的克隆及载体构建:RT-PCR法扩增IDO cDNA全长基因序列,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1上。 2.未成熟DC的分离、培养和鉴定:体外扩增小鼠骨髓来源的未成熟DC,采用光镜、扫描电镜、透射电镜、流式细胞技术鉴定CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子。 3.小鼠IDO基因转染未成熟DC中目的基因表达的鉴定:应用DOTAP脂质体转染剂将pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染未成熟DC,转染后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,用RT-PCR、Western-blot法鉴定基因转染未成熟DC中目的基因的mRNA和蛋白表达情况。 4. pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染对未成熟DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的影响。 5.建立卵蛋白(OVA)致敏/激发小鼠模型:腹腔注射OVA和雾化吸入OVA途径来致敏/激发和激发小鼠,观察BALF中细胞总数和EOS计数、BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平,病理切片观察小鼠肺部气道炎症变化。 6. IDO基因转染未成熟DC对卵蛋白致敏/激发小鼠脾脏CD4~+T细胞增殖、凋亡和分泌细胞因子的影响:分离卵蛋白致敏/激发小鼠脾脏CD4~+T细胞和正常小鼠脾脏CD4~+T细胞,分别与pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染对未成熟DC共培养后,混合淋巴细胞反应和TUNEL法检测CD4~+T细胞增殖、凋亡情况,ELISA法检测细胞培养上清液中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的变化。 7. IDO基因转染未成熟DC对卵蛋白致敏/激发小鼠气道炎症的影响:将IDO基因转染的未成熟DC经气管注入卵蛋白致敏/激发小鼠体内,病理切片观察小鼠肺部气道炎症变化,进行BALF细胞总数和EOS计数,ELISA检测BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平。 结果: 1.用RT-PCR法成功扩增出mIDO cDNA全长序列,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1得pEGFP-N1-IDO,测序后序列完全正确。 2.获得小鼠骨髓来源的未成熟DC。 3.应用DOTAP脂质体转染剂将pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染未成熟DC后,pEGFP-N1-IDO转染组和pEGFP-N1转染组在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光,而对照组没有绿色荧光,RT-PCR可检测到相应目的基因mRNA的表达,Western blot法可检测到相应目的蛋白的表达,而pEGFP-N1转染组和对照组不能检测到IDO的mRNA和蛋白的表达。 4. pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染对未成熟DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的表达无影响,仍以未成熟型为主。 5.成功建立卵蛋白致敏/激发小鼠模型,BALF中细胞总数和EOS计数增高、BALF中IL-4、IL-5的水平增高和IFN-γ水平降低,病理切片观察卵蛋白致敏/激发小鼠模型病理切片肺部气道炎症变化。 6. IDO基因转染未成熟树突细胞能抑制卵蛋白致敏/激发小鼠模型CD4~+ T细胞增殖,pEGFP-N1-IDO质粒转染组CD4~+ T细胞减少,与和pEGFP- N1空质粒转染组和对照组相比差异有统计学意义(P0.05);IDO基因转染未成熟树突细胞可诱导CD4~+ T细胞凋亡,pEGFP-N1-IDO质粒转染组CD4~+T细胞凋亡率为15.3%±2.6%,较对照组和pEGFP- N1空质粒转染组显著增加(P0.01)。pEGFP-N1-IDO质粒转染组培养上清液中IL-4、IL-5水平显著降低,IFN-γ水平显著升高。 7. IDO基因转染未成熟DC能显著地减轻卵蛋白致敏/激发小鼠气道炎症,减少BALF中细胞总数和EOS计数、降低BALF中IL-4、IL-5的水平和增高IFN-γ水平。 结论: 1.成功构建IDO基因高表达的未成熟DC细胞模型。 2. IDO基因转染未成熟DC在体外能诱导OVA致敏/激发小鼠脾脏CD4~+ T细胞呈低反应性,能抑制OVA致敏/激发小鼠Th2细胞活化;IDO基因转染未成熟DC可诱导CD4~+ T细胞凋亡。 3. IDO基因转染未成熟DC在OVA致敏/激发小鼠体内能抑制其Th2细胞活化,改善变应性气道炎症,提示IDO基因表达的上调可能成为诱导哮喘免疫耐受的作用和机制之一,为哮喘的治疗提供了新的思路。
【图文】：

14图 1-1-1 载体 pEGFP-Ｎ1 图谱B/c 小鼠购自第三军医大学大坪医院动物所。要试剂：物 TaKaRa 公司 日盒 Fermentas 公司 立剂盒 Toyobo 公司 日热型 KODplusDNA 聚合酶 Toyobo 公司 日 试剂 TaKaRa 公司 日重庆川东化工集团有限公司 中 重庆川东化工集团有限公司 中 胶回收试剂盒 BioFlux公司 中

-2载体pMD19TVector图谱
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R562.25

【参考文献】

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本文编号：2650303