神经生长因子启动哮喘肾上腺髓质细胞冗余性致肾上腺素释放障碍及蛋白质组学初步研究

发布时间：2020-05-05 17:00

【摘要】： 背景支气管哮喘是一种气道炎症性疾病，其炎症发生与调控气道的神经系统之间存在复杂的相互作用。近年来，众多的实验证明哮喘状态下神经生长因子(nerve growth factor，NGF)明显增高，我们前期的研究也发现支气管哮喘大鼠神经生长因子及其受体表达升高，因此，学术界越来越关注气道神经源性炎症在哮喘发病中的作用。有研究提示哮喘状态下肾上腺髓质嗜铬细胞可能存在肾上腺素的合成和(或)释放障碍，同时外源性NGF可以使肾上腺髓质嗜铬细胞向神经元方向转化，那么哮喘状态下血清中增高的NGF是否对肾上腺髓质嗜铬细胞产生形态上的影响并进而导致其内分泌功能的下降?以及具体的机制如何?近来细胞冗余性概念的提出为肾上腺髓质嗜铬细胞分化障碍提供了可能的理论支撑点。冗余性是指细胞除了必备的功能外还具有“多于必须”的功能，所谓的细胞可塑性也就是指冗余性在细胞表型上的转分化表现。在非生理情况下，细胞的冗余性功能可能启动，导致其专职功能下降或消失，而其兼职功能加强。本研究分别通过体内和体外实验探讨哮喘状态下肾上腺素释放障碍的可能原因，并通过蛋白质组学方法分离和鉴定其中起关键作用的蛋白质。第一章支气管哮喘大鼠肾上腺髓质细胞表型改变与NGF表达水平初探目的观察支气管哮喘状态下大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞(AMCC)形态学的改变以及NGF在肾上腺髓质嗜铬细胞中的表达。方法利用光镜观察哮喘大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞的形态学变化，免疫组织化学结合显微图象分析观察哮喘大鼠髓质嗜铬细胞中NGF的表达变化。结果HE染色光镜下观察都可以见到肾上腺髓质嗜铬细胞不同程度的空泡变性样改变，脂质增多，少数可见纤维样物质伸向皮质。与正常对照组(112.23±2.51)相比，哮喘组(121.79±3.24)大鼠NGF免疫阳性反应在肾上腺髓质嗜铬细胞明显上调(P＜0.05)。结论支气管哮喘时肾上腺髓质嗜铬细胞NGF的表达增高并出现形态学的改变，可能导致肾上腺素合成与释放不足而参与哮喘的发生、发展。第二章神经生长因子启动哮喘大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞冗余性致肾上腺素释放障碍目的探讨支气管哮喘(简称哮喘)状态下肾上腺髓质嗜铬细胞释放肾上腺素不足的可能原因，明确神经生长因子(NGF)在哮喘发病机制中的作用。方法雄性SD大鼠40只，随机分为对照组、哮喘组、NGF干预组、抗NGF抗体干预组、SP组，每组8只，分别干预各组大鼠。电镜观察肾上腺髓质嗜铬细胞超微结构的改变，免疫组织化学结合显微图像分析各组大鼠髓质嗜铬细胞中苯乙醇胺N-甲基转移酶(PNMT)的表达变化，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组大鼠血清中肾上腺素和去甲肾上腺素的变化。结果电镜观察可见：(1)哮喘组、NGF组和抗NGF抗体干预组大鼠肾上腺髓质细胞线粒体增多，并且嗜铬颗粒减少；(2) NGF组肾上腺髓质嗜铬细胞膜可见杵状和绒毛状突起。图像分析结果显示NGF组PNMT平均灰度值(A)为218±38，与对照组(182±25)、哮喘组(198±33)、抗NGF组(195±41)和SP组(195.46±39.82)比较差异有统计学意义(t值分别为23.42、19.76、17.93、18.21，，P均＜0.05)；ELISA结果显示NGF组血清肾上腺素浓度为(2.9±0.5)ng／ml、与对照组[(7.1±0.4) ng／ml]、哮喘组[(5.9±1.7)ng／ml]、抗NGF组[(5.7±0.6)ng／ml]和SP组[(5.91±1.58)ng／ml]比较差异均有统计学意义(t值分别为7.64、5.41、4.96、5.12 P均＜0.01)，哮喘组与对照组比较差异也有统计学意义(t=5.64，P＜0.01)，哮喘组和抗NGF组肾上腺素水平比较差异无统计学意义(t=0.87，P＞0.05)。结论NGF通过启动肾上腺髓质嗜铬细胞的功能冗余性使其表型和功能发生转化，导致肾上腺素水平下降而参与哮喘的发生与发展。第三章神经生长因子启动原代培养的肾上腺髓质细胞功能冗余性致肾上腺素释放障碍目的观察NGF等对原代培养的肾上腺髓质嗜铬细胞生物行为学的影响，探讨可能的机制。方法采用单细胞消化法原代培养肾上腺髓质细胞，密度梯度离心和差速贴壁法分离和纯化肾上腺髓质细胞。相差显微镜、电镜观察外源性NGF、SP作用下肾上腺髓质嗜铬细胞形态和超微结构的改变，ELISA法检测培养上清夜中肾上腺素和去甲肾上腺素浓度的变化。结果NGF干预后2天相差显微镜下可见肾上腺髓质细胞膜表面渐渐长出长丝状突起。电镜下NGF干预后可见肾上腺髓质嗜铬细胞表面丰富的杵状和绒毛状突起，近细胞膜处可见小囊泡形成，细胞浆内线粒体丰富，结构较模糊，部分嵴丢失。ELISA检测发现经NGF干预后培养上清液中肾上腺素浓度较正常组明显降低(P＜0.05)，去甲肾上腺素浓度没有明显改变。SP干预后肾上腺素和去甲肾上腺素浓度没有明显改变。结论NGF通过启动肾上腺髓质细胞功能冗余性使其表型和功能发生改变致肾上腺素合成和释放障碍。第四章NGF启动肾上腺髓质嗜铬细胞冗余性的蛋白质组学初步研究目的初步明确NGF启动肾上腺髓质嗜铬细胞冗余性过程中发挥重要作用的蛋白质，为支气管哮喘的进一步的治疗提供新的思路和可能的治疗靶点。方法运用二维凝胶电泳、质谱分析法并结合生物信息学方法分离和鉴定NGF干预后的差异蛋白质。结果二维凝胶电泳获取肾上腺髓质细胞正常组和NGF干预组的平均蛋白质点数为752±34和693±46，NGF干预组出现有意义的表达上调的点为48个，下调点为37个，随机选取14个表达上调，6个表达下调的差异蛋白质点进行MOLDI-TOF质谱鉴定。质谱鉴定获得了17张较好的肽质量指纹图谱。本实验通过Mascot软件检索MSDB数据库和Profound软件检索MSDB数据库初步鉴定17个可能与NGF启动肾上腺髓质细胞冗余性致肾上腺素释放障碍过程中相关的差异表达蛋白质，其中信号转导蛋白Rho GDP dissociation inhibitor(GDI) alpha、分子伴侣蛋白HSP27、外周蛋白中间丝蛋白(Peripherin intermediatefilament protein)可能在此过程发挥重要作用。结论RhoGDIα蛋白、分子伴侣蛋白HSP27、外周蛋白中间丝蛋白可能在NGF启动肾上腺髓质嗜铬细胞冗余性过程中发挥重要作用。
【图文】：

哮喘大鼠支气管肺组织X400

肾上腺髓质

哮喘大鼠肾上腺髓质x100
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R562.25

【引证文献】