特发性肺纤维化中TGF-β1介导的DNA甲基转移酶致端粒酶活性异常及其干预研究

发布时间：2020-05-06 17:38

【摘要】：特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种以进行性呼吸困难、运动耐力下降、肺实质的间质性浸润及肺限制性肺通气功能障碍为主要特征的慢性进展性纤维化性间质性肺炎,呼吸衰竭是IPF患者死亡的根本原因,确诊后的平均中位生存期3-5年,目前除了肺移植以外尚无任何有效的治疗方法。该病主要是老年人的疾病,好发于成年男性,确诊时年龄多为65岁以上。目前已有证据表明,IPF和衰老之间存在相关性,是一种多种原因及途径共同作用的衰老相关性疾病,端粒酶及DNA甲基化均作为细胞衰老相关因素,参与了IPF的发生发展。IPF病情的发生发展中,TGF-β可以导致端粒酶异常,而DNA甲基化可能参与其中。TGF-β和端粒酶作为重要的分子共同参与了IPF的进程,可能使细胞不断发生细胞复制性衰老的恶性循环。研究表明TERT和DNMT3a、DNMT3b分别被认为是端粒酶活性及DNA甲基化的关键限速因子,可以分别作为反映端粒酶活性及DNA甲基化水平的指标对端粒酶和DNA甲基化进行研究。那么在IPF中TGF-β1是否可以导致端粒酶活性及DNA甲基转移酶发生改变?如何发生变化?有无相关干预措施?本课题以IPF中TGF-β1引起端粒酶活性与DNA甲基转移酶的变化及两者的相互关系为研究切入点,探讨其在IPF发病中的作用及干预措施。首先研究IPF患者和正常人群外周血中TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表达情况,证实IPF患者和正常人群中TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表达存在差异;之后在动物实验中进一步研究年龄因素对肺纤维化小鼠TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表达的影响,证实上述指标的变化及动物模型病变程度与年龄因素相关;最后进行细胞实验验证,研究TGF-β1诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT及DNMT3a、DNMT3b的表达异常、相互作用及干预措施。证实TGF-β1通过DNA甲基化调控TERT表达并提出相关干预措施。共分为三个部分,六个实验。第一部分IPF患者外周血TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表达研究实验一IPF患者外周血TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表达研究目的:研究IPF患者中外周血白细胞TERT及外周血血清中DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表达情况。方法:选择不合并有其他疾病的年龄"g60岁男性IPF患者10名为IPF组,选择没有基础疾病的年龄"g60岁男性10名为对照组,收集临床基本数据,ELISA检测对照组及IPF组血清TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b蛋白表达的影响;Western Blot法检测对照组及IPF组外周血白细胞TERT蛋白表达的影响。结果:1.IPF组血清TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b蛋白的表达与对照组相应指标比较均表达升高,P0.05,差异有统计学意义。IPF组血清IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b的表达与TGF-β1的表达均呈正相关。2.实验组外周血白细胞TERT蛋白相对表达量与对照组相比表达升高,P0.05,差异有统计学意义。结论:IPF患者外周血血清中TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b的含量及外周血白细胞TERT的含量均高于正常对照组健康人群。第二部分年龄因素对小鼠肺纤维化模型TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表达影响的研究实验二年龄因素对小鼠肺纤维化模型中TERT及TGF-β1表达影响的研究目的:研究小鼠肺纤维化过程中年龄因素对TERT活性变化的影响,探讨TGF-β1、IL-1β及IL-6在IPF过程中的变化规律及意义。方法:128只10-12周龄雄性C57BL/6小鼠,无特殊病原体SPF级,饲养至20周龄时,随机分为青年肺纤维化模型组(A组),青年正常对照组(B组),老年肺纤维化模型组(C组),老年正常对照组(D组),每组32只。A组小鼠气管内注入博莱霉素(5mg/kg)制造肺纤维化模型;B组气管内注入同等剂量生理盐水进行对照,C组和D组饲养至26周龄后分别对应使用A组和B组的造模方法制造老年肺纤维化组模型和老年正常对照组模型。造模后的第7、14、21、28天分别在A组、B组、C组和D组中每组随机抽取8只小鼠,用腹主动脉采血法处死后,留取肺组织标本及血液标本待测。小鼠肺组织HE染色及Ashcroft评分评定肺纤维化程度;Masson染色观察小鼠肺组织胶原分布;小鼠肺组织E-Cad、Vimentin、α-SMA免疫组化及灰度值检测;ELISA法检测小鼠血浆中TGF-β1、IL-1β、IL-6蛋白的含量;Western Blot法检测小鼠肺组织TERT蛋白含量。结果:1.向小鼠气管注入BLM(5mg/kg)制造小鼠肺纤维化模型造模成功。与青年肺纤维化小鼠相比,老年肺纤维化模型组小鼠纤维化程度更加严重,P0.05,差异有统计学意义。2.与对照组小鼠相比,模型组小鼠E-Cad表达降低,α-SMA及Vimentin表达增高,P0.05,差异有统计学意义,三者随病程进展而变化明显,三者各自差异在对照组28天、模型组14天、模型组28天较为显著;与青年模型组小鼠相比,老年模型组小鼠各相同造模时间点E-Cad阳性率低,α-SMA及Vimentin阳性率高,P0.05,差异有统计学意义。3.A组与C组血清中TGF-β1、IL-1β及IL-6含量高于B组和D组,三者在A组与B组、C组与D组同一时间点两两比较P0.05,差异具有统计学意义;但在A组与C组、B组与D组同一时间点两两比较P0.05,差异不具有统计学意义。4.与对应时间点B组与D组相比,A组与C组第7天、第14天、第21天和第28天肺组织TERT蛋白相对表达量升高,P0.05,差异具有统计学意义;与各自第7天、第21天和第28天表达量相比,A组与C组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量升高,P0.05,差异具有统计学意义。5.与对应时间点B组和A组相比,D组和C组第14天和第28天肺组织TERT蛋白相对表达量升高,P0.05,差异具有统计学意义。B组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量与其第28天相比表达升高,D组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量与其第28天相比表达升高,P0.05,差异无统计学意义。6.A组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量、A组第28天肺组织TERT蛋白相对表达量、B组第14天或28天肺组织TERT蛋白相对表达量之间三者两两比较,P0.05,差异具有统计学意义;C组第14天肺组织TERT蛋白相对表达量、C组第28天肺组织TERT蛋白相对表达量、D组第14天或28天肺组织TERT蛋白相对表达量之间三者两两比较,P0.05,差异具有统计学意义。7.C组和A组肺组织TERT蛋白相对表达量均在第14天达到高峰,第28天明显下降。但与A组相比,C组TERT蛋白相对表达量变化波动大。结论:1.小鼠肺纤维化过程中,肺组织E-Cad含量减少,α-SMA及Vimentin含量升高;老年小鼠肺纤维化程度更严重;肺纤维化小鼠血清中TGF-β1、IL-1β及IL-6含量明显升高,TGF-β1、IL-1β及IL-6参与了肺纤维化的发生发展。2.肺纤维化小鼠肺组织TERT的活性变化是先升高再降低,老年肺纤维化小鼠肺组织TERT变化波动程度大,年龄因素可能通过影响小鼠肺纤维化模型中肺组织TERT的活性来改变小鼠肺纤维化病变程度。实验三年龄因素对小鼠肺纤维化模型中DNMT3a、DNMT3b及CDH1表达影响的研究目的:研究小鼠肺纤维化过程中年龄因素对DNMT3a、DNMT3b及CDH1表达的影响。方法:32只10-12周龄雄性C57BL/6小鼠,无特殊病原体SPF级,饲养至20周龄时,随机分为青年肺纤维化模型组(A组),青年正常对照组(B组),老年肺纤维化模型组(C组),老年正常对照组(D组),每组8只,A组小鼠气管内注入博莱霉素稀释液制造肺纤维化模型;B组气管内注入同等剂量生理盐水进行对照,C组和D组饲养至26周龄后分别对应使用A组和B组的造模方法制造老年肺纤维化组模型和老年正常对照组模型。麻醉和造模方法与实验二中小鼠麻醉和造模方法相同;C组和D组饲养至26周龄后分别对应使用A组和B组的造模方法制造老年肺纤维化组模型和老年正常对照组模型。A组、B组、C组和D组每组小鼠于造模后的第28天分别采用腹主动脉采血法处死,留取肺组织标本待测。小鼠肺组织HE染色及Ashcroft评分评定肺纤维化程度;小鼠肺组织Masson染色观察胶原分布;Western Blot法检测小鼠肺组织DNMT3a、DNMT3b和CDH1的蛋白含量。结果:1.与B组相比,A组DNMT3a、DNMT3b蛋白表达明显升高,P0.05,差异有统计学意义;与D组相比,C组DNMT3a、DNMT3b蛋白表达明显升高,P0.05,差异有统计学意义;与A组相比,C组DNMT3a、DNMT3b蛋白表达明显升高,P0.05,差异有统计学意义;与B组相比,D组DNMT3a、DNMT3b蛋白表达无明显变化,P0.05,差异无统计学意义。2.与B组相比,A组CDH1蛋白表达明显降低,P0.05,差异有统计学意义;与D组相比,C组CDH1蛋白表达明显降低,P0.05,差异有统计学意义;与A组相比,C组CDH1蛋白表达明显降低,P0.05,差异有统计学意义;与B组相比,D组CDH1蛋白表达无明显变化,P0.05,差异无统计学意义。结论:肺纤维化小鼠肺组织DNMT3a、DNMT3b的表达升高,CDH1表达降低,老年肺纤维化小鼠较青年肺纤维化小鼠更明显。年龄因素可能通过影响小鼠肺纤维化模型中肺组织DNMT3a、DNMT3b及CDH1的表达来改变肺纤维化病变程度。第三部分TGF-β1诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT及DNMT3a、DNMT3b的表达异常及干预措施的研究实验四TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1、TERT表达影响的研究目的:研究TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1、TERT及IL-1β和IL-6表达的影响。方法:培养A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞,分为对照组、TGF-β1 2μmol/L干预组、TGF-β1 5μmol/L干预组和TGF-β1 10μmol/L干预组。β-gal染色法检测TGF-β1梯度刺激对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞衰老的影响;ELISA检测TGF-β1梯度刺激对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β、IL-6蛋白表达;Quantitative Real-time PCR检测TGF-β1梯度刺激对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β、IL-6 m RNA的表达;观察TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞形态和胶原蛋白表达的影响;Quantitative Real-time PCR检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA的表达;Quantitative Real-time PCR检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1及TERT m RNA的表达;Western Blot法检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT蛋白表达的影响。结果:1.正常对照组几乎未出现衰老细胞,干预组细胞衰老百分比随TGF-β1浓度升高而升高。2.TGF-β1 2μmol/L干预组、TGF-β1 5μmol/L干预组及TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β和IL6蛋白及m RNA的表达明显升高,P0.05,差异有统计学意义;两者随着TGF-β1浓度的升高,表达也进一步升高,TGF-β1 5μmol/L干预组、TGF-β1 10μmol/L干预组与TGF-β1 2μmol/L干预组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β和IL6蛋白及m RNA的表达明显升高,P0.05,差异有统计学意义;但TGF-β1 5μmol/L干预组与TGF-β1 10μmol/L干预组作用相当,P0.05,差异无统计学意义。3.光镜下观察对照组细胞形态呈典型的上皮细胞样形态,TGF-β1 10μmol/L干预组细胞出现典型的间质细胞样形态,Masson染色后光镜下观察对照组细胞几乎未见蓝色胶原蛋白表达,而TGF-β1 10μmol/L干预组细胞蓝染胶原蛋白表达明显增多,表达范围明显增加。4.TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达明显升高,P0.05,差异有统计学意义。5.TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a和DNMT3b m RNA的表达明显升高,TERT和CHD1基因m RNA的表达明显降低,P0.05,差异有统计学意义。TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT蛋白表达明显降低,P0.05,差异有统计学意义。结论:1.TGF-β1可导致A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞发生衰老,促进A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-1β、IL6、COL-I、FN1和Tensin-C的表达。2.TGF-β1促进了A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a和DNMT3b的表达,抑制TERT和CHD1的表达。实验五TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT启动子活性及DNMT3a、DNMT3b转录因子与TERT启动子结合影响的研究目的:研究TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT启动子活性及DNMT3a、DNMT3b转录因子与TERT启动子结合的影响。方法:培养A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞,分为对照组、TGF-β1 10μmol/L干预组。荧光素酶法检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT启动子活性的影响;染色质免疫共沉淀法检测TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a和DNMT3b与TERT启动子结合的影响。结果:1.TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT启动子活性下降,P0.05,差异有统计学意义。2.TGF-β1 10μmol/L干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a和DNMT3b转录因子与TERT启动子的相对结合量增大,P0.05,差异有统计学意义。进一步比较DNMT3a和DNMT3b转录因子的富集情况,DNMT3a转录因子的富集比DNMT3b转录因子的富集多,P0.05,差异有统计学意义。结论:TGF-β1促进了DNMT3a,DNMT3b转录因子与TERT启动子的结合,DNMT3a转录因子与TERT启动子的结合起较大作用。对TERT启动子甲基化水平产生一定影响,进而使TERT启动子活性下降。实验六DNMT3a si RNA干扰与TERT过表达对TGF-β1诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞纤维化及衰老干预作用的研究目的:研究DNMT3a si RNA干扰与TERT过表达对TGF-β1诱导的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞纤维化及衰老的干预作用。方法:培养A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞,分为对照组、TGF-β1干预组、TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组及TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组,对DNMT3a行si RNA干扰;选择慢病毒为载体,进行质粒慢病毒转染对TERT进行过表达处理,TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组为质粒慢病毒转染,对照组、TGF-β1干预组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组行LV-GFP质粒慢病毒空载对照。共聚焦激光扫描荧光显微镜检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞荧光;Masson染色检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞胶原蛋白的表达;Quantitative Real-time PCR检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达的影响;Western Blot法检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞TERT、DNMT3a、DNMT3b和CDH1蛋白表达的影响;β-gal染色法检测各组A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞的衰老情况。结果:1.DNMT3a si RNA干扰和TERT过表达成功。2.Masson染色后对照组细胞几乎未见蓝色胶原蛋白表达,而TGF-β1干预组细胞出现大量蓝染胶原蛋白,其表达量及表达范围均明显增加,与对照组相比,P0.05,差异有统计学意义。TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组均有蓝染胶原蛋白表达,三组表达无差别,三组分别与对照组相比,蓝染胶原蛋白表达量及表达范围增加,P0.05,差异有统计学意义;三组分别与TGF-β1干预组相比,蓝染胶原蛋白表达量及表达范围均较减少,P0.05,差异有统计学意义。3.TGF-β1干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I,FN1,Tensin-C m RNA表达明显升高,P0.05,差异有统计学意义。TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组三组的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达升高,三组分别与对照组相比,COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达升高,P0.05,差异有统计学意义;三组分别与TGF-β1干预组相比,COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表达降低,P0.05,差异有统计学意义。4.TGF-β1干预组与对照组相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b蛋白表达明显升高,TERT、CDH1蛋白表达明显降低,P0.05,差异有统计学意义。TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组三组的A549人肺泡Ⅱ型上皮细DNMT3a、DNMT3b蛋白表达升高,TERT、CDH1蛋白表达降低,三组表达无差别;但分别与TGF-β1干预组相比,三组的A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞DNMT3a、DNMT3b蛋白表达降低,TERT、CDH1蛋白表达升高,P0.05,差异有统计学意义。5.对照组几乎未出现衰老细胞,而TGF-β1干预组出现大量衰老细胞,且衰老细胞的比例最大,而TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰组、TGF-β1干预+TERT过表达组与TGF-β1干预+DNMT3a si RNA干扰+TERT过表达组这三组均有衰老细胞表达,衰老细胞的比例三组表达无差别,但三组分别与对照组相比,衰老细胞增多及比例增大,P0.05,差异有统计学意义;三组分别与TGF-β1干预组相比,衰老细胞减少及比例降低,P0.05,差异有统计学意义。结论:干扰DNMT3a si RNA与过表达TERT均可以减轻TGF-β1对A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞致纤维化作用和A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞发生衰老的程度。但DNMT3a si RNA干扰与TERT过表达之间没有叠加作用。
【图文】：

TGF-β1标准曲线

IL-1β标准曲线
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563
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本文编号：2651623