甘露糖对急性肺损伤的保护作用及其通过甘露糖受体抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症

发布时间：2020-05-07 01:14

【摘要】： 前言: 急性肺损伤(acute lung injury,ALI),是呼吸系统疾病中的危重症,其定义是:心源性以外的各种肺内外致病因素引起的急性,进行性缺氧性呼吸衰竭,是肺部炎症和通透性增加的综合征。目前认为,肺内过度性、失控性炎症反应是导致各种病因所致ALl的根本原因。而目前对ALI仍没有确切有效又安全低副作用的药物。随着糖生物学的发展,某些糖类的抗炎生物学功能逐渐被认识。甘露糖这一简单的己糖已被发现具有抗炎作用。甘露糖能抑制伤口愈合时的炎症反应,抑制中性粒细胞的氧化爆发,甘露糖的衍生物对腹膜炎,佐剂性关节炎有抗炎作用。那么甘露糖对炎症过度反应的ALl有无作用?目前国内外未见报道。目的: 研究甘露糖对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠急性肺损伤的保护作用;并比较它与另外三种具有相同分子量的己糖(葡萄糖,半乳糖,果糖)对ALI的抗炎效应。方法: 雄性SD大鼠,随机分为10组:1.对照组;2.LPS组;3-6.甘露糖不同剂量组(15,45,135,405 mg/kg);7-9.葡萄糖,半乳糖,果糖(135 mg/kg)组;10.地塞米松(dexameathone,DXM)(2 mg/kg)组。通过气管内滴注LPS(3mg/kg)建立ALI模型,在滴注前5分和滴注后3小时,尾静脉注射各组用药。滴注LPS 6小时后处死动物,行肺湿/干重比,肺渗透指数(pulmonarypermeability index,PPI),支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白细胞和中性粒细胞计数,肺和BALF中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α,白介素(interleukin,IL)-10检测,并观察光学显微镜下肺损伤的程度。结果: 1.甘露糖减轻LPS诱导的肺水肿和蛋白渗出 LPS组的肺湿/干重比(4.56±0.16)与正常组(4.30±0.18)比较明显升高(P＜0.01),DXM(阳性对照药)(2 mg/kg)静脉注射明显抑制LPS诱导的肺部水肿(P＜0.05),静脉注射甘露糖(135,405 mg/kg)减少肺湿/干重比(P＜0.05):甘露糖405 mg/kg的作用强度相当于DXM 2 mg/kg。半乳糖,葡萄糖和果糖135mg/kg静脉注射不能减轻肺水肿。同时,甘露糖能明显抑制PPI的上升,甘露糖135 mg/kg(4.32±0.45)和405 mg/kg(4.04±0.86)的抑制效应均强于DXM 2 mg/kg(4.37±0.88),相反,葡萄糖,半乳糖,果糖并无明显的抑制作用。 2.甘露糖抑制LPS诱导的肺部炎症细胞侵润气道内滴入LPS引起肺部急性的炎症反应,使BALF中的白细胞数急剧上升。DXM(2 mg/kg)能明显减少LPS诱导的BALF中的白细胞数(P＜0.01)。甘露糖15、45、135和405 mg/kg静脉注射呈剂量依赖性地减少肺部炎症细胞的聚集,使BALF中白细胞数以及中性粒细胞数明显下降。而葡萄糖,半乳糖,果糖135 mg/kg并无明显的抑制作用。甘露糖135 mg/kg与其它三种己糖135mg/kg的效应具有显著性差别(p＜0.05)。 3.甘露糖对MPO和SOD活力的影响 LPS组肺匀浆中和BALF中MPO水平升高,与对照组比较分别上升了26.3%和9.5%(P＜0.05)。甘露糖剂量依赖性地减少LPS诱导的肺匀浆中和BALF中MPO活性的上升,甘露糖405 mg/kg的抑制强度相当于DXM 2 mg/kg。相反,葡萄糖,半乳糖,果糖组的肺匀浆中和BALF中的MPO均未见降低。同时,LPS组SOD活力下降,而静脉注射甘露糖剂量依赖性地减少LPS诱导的SOD活力下降。静脉给予DXM或其它三种己糖对SOD活力升高均无明显作用。甘露糖135 mg/kg与其它三种同样剂量的己糖的作用具有显著性差异(P＜0.05)。 4.甘露糖抑制TNF-α和IL-10的产生 LPS组的肺匀浆和BALF中的TNF-α水平显著上升,分别达到对照组的6倍和40倍(P＜0.01)。甘露糖剂量依赖性地减轻LPS诱导的TNF-α的上升,DXM 2mg/kg静脉注射也有明显的抑制作用(p＜0.05),而葡萄糖,半乳糖,果糖没有明显作用。抗炎因子--IL-10在肺匀浆中的水平于各组中均无显著性差异(数据未显示)。在BALF中,LPS组的IL-10水平升高,甘露糖135 mg/kg组,405 mg/kg组及DXM组的IL-10水平均有明显下降(P＜0.05)。 5.甘露糖改善LPS诱导的肺部病理损伤对照组大鼠肺组织HE染色可见肺泡结构完整,肺泡壁无水肿,肺实质无明显炎症细胞浸润,LPS组大鼠肺泡壁明显水肿增厚,肺间质中性粒细胞明显浸润,有出血、水肿及中性粒细胞移行至肺泡腔,肺泡腔内透明膜形成。甘露糖45,135,405 mg/kg和DXM 2 mg/kg减轻了LPS诱导的肺部炎症。低剂量甘露糖(15mg/kg),以及其它三种己糖并无明显的作用。同时,LPS组肺损伤病理评分(4.8±0.4)比对照组(0.2±0.1)明显增高(P＜0.01)。甘露糖15、45、135和405mg/kg静脉注射呈剂量依赖性降低肺损伤病理评分,其分值分别是:4.6±0.3,3.8±0.4,2.5±0.4,及1.9±0.3。葡萄糖,半乳糖,果糖组与LPS组比较,肺损伤病理评分无显著差异(P＞0.05)。结论: 静脉注射甘露糖能降低LPS诱导大鼠急性肺损伤时的肺部毛细血管通透性的增加,减少蛋白渗出及肺水含量,减轻肺组织中PMN浸润程度,抑制肺组织和BALF中TNF-α水平升高,降低肺组织和BALF的MPO水平,提升肺组织SOD活力,并改善肺组织炎症病理变化。而另外三种单糖—葡萄糖,半乳糖和果糖,对LPS诱导的大鼠ALI无明显作用。前言: 甘露糖是一个分子量为180.2的简单单糖,我们前一部分的实验已经发现它对LPS诱导的大鼠内毒素性急性肺损伤具有保护作用,它能降低LPS诱导的大鼠急性肺损伤时毛细血管通透性的增加,减少蛋白渗出及肺水含量,减轻肺组织中中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)浸润程度,抑制肺组织和BALF中TNF-α水平升高,降低肺组织和BALF的MPO水平,提升肺组织SOD活力,并改善肺组织炎症病理变化。国外学者也发现甘露糖能抑制伤口愈合时的炎症反应,减少渗出液中中性粒细胞的数量,抑制中性粒细胞的氧化爆发;甘露糖的衍生物,6—磷酸—甘露糖,对腹膜炎,佐剂性关节炎,伤口愈合时的炎症具有抗炎作用。虽然中性粒细胞是炎症中重要的效应细胞,但是巨噬细胞是更为关键的炎症早期时的激动细胞,巨噬细胞释放的炎症因子及其它介质对中性粒细胞的粘附,募集,迁移,活化具有重要意义。在巨噬细胞表面分布有甘露糖受体(mannosereceptor,MR),其C型凝集素样糖类识别域(C-type lectin-like domain,CTLD)能介导MR与以甘露糖、岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖为末端的糖类结合。MR对保持内环境稳定,免疫监督(包括识别病原体,激活细胞,递呈抗原)均有作用。是否甘露糖能通过与MR的相互作用影响炎症状态下巨噬细胞的的功能,从而抑制PMN募集与＼活化,减轻炎症反应,目前国际上未见报道。目的: 本实验的研究的目的就在于探讨甘露糖对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的离体小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞炎症反应的影响,并探讨甘露糖受体在其中的作用。方法: 采用腹腔灌洗和支气管肺泡灌洗,分别提取小鼠腹腔巨噬细胞及肺泡巨噬细胞。实验使用了两种不同的MR阻断方法:使用甘露聚糖竞争性抑制以及以质粒载体干扰RNA的方法干扰甘露糖受体合成。巨噬细胞均分为:1.对照组:加入等体积培养液;2.LPS组,加入终浓度为1 ug/ml的LPS;3.甘露糖不同剂量组(0.01,0.1,1,10,100mM):提前5分钟先加入不同剂量甘露糖,随后加入LPS 1 ug/ml;4.甘露聚糖组:在加入LPS前30分钟先加入甘露聚糖2 mg/ml,在加入LPS 1ug/ml前5分钟加入甘露糖1mM;5.SiRNA组:于转染细胞中提前5分钟先加入甘露糖1mM,随后加入LPS 1 ug/ml。加LPS 1.5h后测核因子NF-κB活性,4h后以中性红法检测巨噬细胞吞噬功能,16h后以ELISA法测定巨噬细胞培养上清TNF-α和IL-1β水平,流式细胞术检测细胞的MR表达,RT—PCR测定胞内TNF—α,IL-1β及MR的mRNA水平,Western Blot检测细胞的MR蛋白表达。结果: 1.巨噬细胞的pGCsi载体转染:pGCsi载体转染小鼠腹腔或肺泡巨噬细胞48h后,荧光镜下可得Mrc1-3质粒的转染效率分别为40.5%和43.7%;RT—PCR测定MR的mRNA表达量分别为未转染组细胞的54.0和56.1%;Western-blot分析提示pGCsi载体转染后的腹腔或肺泡巨噬细胞的MR的蛋白显著减少;流式细胞术检测提示转染质粒组MR表达阳性细胞百分率分别下降为对照组的56.1%和59.7%。结果表明,转染Mrc1-3质粒能明显抑制腹腔或肺泡巨噬细胞的甘露糖受体的表达,证明载体质粒干扰MR的表达成功。 2.LPS激发巨噬细胞炎症并下调MR表达:小鼠的腹腔或肺泡巨噬细胞以1ug/ml的LPS刺激,4h后吞噬功能明显增强,光镜下观察胞内中性红颗粒增多增浓,摄取中性红的吸光度(OD_(540))值显著上升;LPS 1 ug/ml共育16h后引起腹腔或肺泡巨噬细胞细胞上清液中前炎症因子TNF-α和IL—1β的8～44倍的剧烈上升;胞内TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平显著增加,提示腹腔或肺泡巨噬细胞在LPS作用下引发了炎症性的吞噬和分泌功能的变化。同时,LPS 1 ug/ml共育16h后对腹腔或肺泡巨噬细胞的MR表达有下调作用,表现为流式细胞术检测发现巨噬细胞表面MR的表达分别比正常对照组下降了31.2%和17.4%;WesternBlot检测提示巨噬细胞MR的蛋白表达水平有明显的下调;RT-PCR检测发现巨噬细胞表达甘露糖受体mRNA的量下降,分别约为正常对照组的67.3%和66.2%。 3.甘露糖拮抗LPS诱导的巨噬细胞炎症并上调MR:在小鼠的腹腔或肺泡巨噬细胞中,甘露糖0,0.01,0.1,1,10,100mM呈剂量依赖性减少LPS诱导的小鼠腹腔或肺泡巨噬细胞的炎症反应,表现为抑制腹腔或肺泡巨噬细胞吞噬功能,甘露糖1 mM组的吸光度分别比LPS组的吸光度下降了24.2%和11.8%;抑制腹腔或肺泡巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1β释放,甘露糖1,10,100 mM组与LPS组相比有非常显著的差异;甘露糖(0.1,1,10 mM)剂量依赖性地抑制腹腔或肺泡巨噬细胞的TNF-α和IL-1β的mRNA表达,甘露糖10 mM使腹腔巨噬细胞的TNF-α和IL-1βmRNA降为LPS组的66.4%和58.2%,使肺泡巨噬细胞的TNF-α和IL-1βmRNA降为LPS组的61.8%和61.3%。甘露糖在抑制巨噬细胞炎症的同时,上调了巨噬细胞表面MR的表达。我们以抗甘露糖受体抗体作流式细胞分析,以Western Blot检测巨噬细胞MR的蛋白表达,以RT-PCR测定胞内MR的mRNA表达水平,均发现预先加入不同浓度(0.1,1,10 mM)的甘露糖,与LPS组相比,能剂量依赖性地上调巨噬细胞的MR表达水平。 4.阻断MR,能阻断甘露糖的抗炎效应:使用甘露聚糖2 mg/ml竞争性抑制或者以质粒载体干扰RNA的方法干扰甘露糖受体后,再给予甘露糖1mM,则明显抑制了甘露糖1mM原有的抗炎效应,表现为:对LPS诱导的增强中性红吞噬作用无明显抑制;不能减少LPS诱导的培养上清中增多的炎症因子TNF-α和IL-1β;巨噬细胞胞内TNF-α和IL—1βmRNA表达水平仍维持在高水平。同时,流式细胞术,RT-PCR,Western Blot的检测显示,在预先加入甘露聚糖2mg/ml或者预先以pGCsi载体转染后的巨噬细胞中再给予甘露糖1mM,不能提升MR的mRNA的表达水平和蛋白表达水平,相反,在LPS或者LPS和RNA干扰的双重作用下,这两组的MR有不同程度的下调,其中载体转染组的甘露糖受体表达水平为最低。 5.甘露糖抑制LPS所诱导的巨噬细胞核内NF-κb/p65的表达:Western Blot检测显示,在正常腹腔或肺泡巨噬细胞核蛋白中有低水平的NF-κb/p65表达,经LPS 1 ug/ml刺激1.5h后核内NF-κb/p65表达明显增高,分别达到正常对照组的2.4和4.5倍。预先给予甘露糖(0.1,1,10 mM),能剂量依赖性地抑制LPS所诱导的核内NF-κb/p65高水平表达。而以甘露聚糖2mg/ml预处理,或者预先以pGCsi载体转染后的腹腔或肺泡巨噬细胞,再给予甘露糖1mM共育1.5h,则不能阻止LPS诱导的核内NF-κb/p65表达上调。结论: (1)甘露糖能抑制LPS诱导的小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞炎症反应,抑制LPS诱导的巨噬细胞吞噬功能的增强,抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1βmRNA的合成和炎症因子蛋白在上清中的释放: (2)LPS对小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞的MR有下调作用,甘露糖在发挥抗炎效应的同时对MR有上调作用; (3)以特异的MR自然配体——甘露聚糖竞争性抑制MR或以转染脂质体干扰MR的合成后,能够阻断甘露糖的抗炎效应,表明甘露糖的抗炎效应至少部分是通过MR实现的。 (4)甘露糖能抑制LPS诱导的巨噬细胞的核因子NF-κB的活性,提示甘露糖可能通过NF-κB信号通路,进而在mRNA水平上抑制LPS所致的腹腔或肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-1β的表达。
【图文】：

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氨基酸序列,甘露糖受体

体来识别病原体的分子模式。MR最初在内质网合成时为无活性的前体，自高尔基体分泌后才成为具有生物学活性的分子。甘露糖受体的四位成员都具有相似的整体结构(见图1)。①胞外的富含半肤氨酸区域 (cysteinerichdomain，cR):为对称的三叶草样结构。具有凝集素活性，能够结合504一4一N一乙酞半乳糖胺、504一3一N一乙酞半乳糖胺和504一3一半乳糖，这种结合无需CaZ十参与。因此能识别腺垂体激素如促黄体激素，，促甲状腺激素，硫酸软骨素A和B，LewiS“和Lewis!型硫酸化低聚糖。MR家族成员间的CR序列的同源性是25弓0%。②n型纤连蛋白重复区(FNn):FNn区域因与11型纤维连接蛋白 (FNn)的氨基酸序列高度相似而得名。在甘露糖受体家族成员间，此区域是最保守的，44%p叼63%的氨基酸序列相同。学者们推测FNll区域的功能是结合胶原蛋白，也己证实Endo180的FNll区域可与胶原结合
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563.8

【参考文献】