半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活化在哮喘气道炎症中作用的研究

发布时间：2017-03-25 10:00

  本文关键词：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活化在哮喘气道炎症中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景支气管哮喘(简称哮喘)是全球范围内常见的慢性呼吸道疾病,近年来在世界各国均有逐年上升的趋势,已成为严重威胁人类健康的一类疾病。据统计,全球约有3亿哮喘患者,全球患病率1%-18%,我国约有1000～3000万哮喘患者,并有不断增加的趋势。哮喘是一种由基因与环境因素共同导致的复杂疾病。尽管哮喘基础研究已取得较大的进步,但目前发病机制和发展环节尚未完全明确,临床上对于哮喘的急性加重以及重症哮喘的治疗亦不是很满意。因此,探讨哮喘气道炎症发病机制、寻找新的治疗或预防靶点是呼吸系统疾病研究重点和热点。 支气管哮喘是一种以气道慢性炎症、粘液分泌增加、气道重塑及气道反应性增高为主要特征的免疫变态反应性疾病。其中,气道炎症为最主要的病理变化,并决定气道阻塞和气道高反应性的程度。随着研究的不断拓展和深入,关于哮喘发病机制的假说不断增多,得到最广泛关注的是哮喘发病的“卫生学假说”,其核心为Th1/Th2失衡。该学说认为哮喘的发生是由于体内Th1/Th2平衡失调所致,即正常人以Th1/Th2保持平衡,但哮喘患者体内则Th0向Th2分化过度,使Th2占优势。Th1/Th2失衡是哮喘发病的重要基础,Yh2优势是过敏性哮喘形成及进展的关键性机制。除了炎症细胞和炎症介质,气道结构细胞特别是气道上皮细胞也参与气道炎症的发生与发展,气道上皮细胞(HBE)首先作为气道的第一道防线抵抗外来侵害,同时在气道固有免疫中也发挥着重要作用。研究证明HBE是哮喘联系固有免疫与获得性免疫的桥梁。随着对炎症性疾病的深入研究以及对炎症通路的逐步了解,炎症复合体(inflammasome)成为多种炎症性疾病的研究重点,其中研究最多的就是NLRP3炎症复合体。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain3)炎症复合体是由NLRP3蛋白、凋亡相关点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和Caspase-1组成的多蛋白复合体。NLRP3蛋白能通过ASC接合半胱氨酸天冬氨酸酶-1前体pro-Caspase-1(45KDa)组装成NLRP3炎症复合体,组装后的pro-Caspase-1能自动激活形成有活性的Caspase-1,活化的Caspase-1(10KDa和20KDa)促进IL-1家族细胞因子(IL-1β, IL-18, IL-33等)成熟与分泌,从而参与炎症反应。 为了揭示NLRP3炎症复合体组装后激活的Caspase-1在哮喘气道炎症的作用机制,本研究选择了C57BL/6小鼠和人气道上皮细胞(16HBE)作为研究对象,观察在哮喘小鼠模型以及人气道上皮细胞炎症微环境中Caspase-1的表达,以及下游细胞因子IL-1家族细胞因子的生成,并通过Ac-YVAD-cmk阻断Caspase-1活化观察其是否可以引起IL-1家族细胞因子表达的改变,从而为完善哮喘气道炎症机制研究及治疗方法上提供参考。 第一部分小鼠哮喘模型建立 目的建立OVA致敏和激发雌性C57BL/6小鼠哮喘模型。 方法SPF级雌性C57BL/6小鼠(南方医科大学实验动物中心)18只,6-8周,体重18-20g,随机分为3组,对照组(A组)、哮喘组(B组)和Caspase-1特异性抑制剂(Ac-YVAD-cmk)组(C组),B、C组小鼠于实验流程第0天、7天、14天给予腹腔注射鸡卵蛋白(OVA)液200μ1致敏,A组仅用生理盐水替代致敏。B、C组小鼠于第21-27天雾化激发,给予2%OVA40ml,经超声雾化器雾化吸入30min,1次/天；C组每次激发前30min给予Ac-YVAD-cmk溶液5μg/g腹腔注射；对照组用生理盐水代替OVA雾化激发。末次激发24h后,各组小鼠雾化吸入乙酰甲胆碱,用BUXCO无创肺功能检测仪记录气道反应性监测指标增强呼气间歇(Penh)值。第29天采用水合氯醛麻醉小鼠,摘眼球放血处死,75%酒精消毒,行支气管肺泡灌洗术,回收BALF,离心取细胞沉渣,重悬充板行细胞计数；涂片,瑞氏染色,细胞分类计数；取右上肺组织4%多聚甲醛固定,酒精脱水,石蜡包埋,常规HE染色,光学显微镜下观察组织形态,气管和血管周围炎症细胞浸润情况。 结果 1.致敏、激发哮喘过程小鼠行为学观察：B组、C组诱发哮喘后后出现不同程度呼吸急促、立毛、前肢搔鼻和烦躁不安,然后出现口唇紫绀、呼吸急促、二便失禁、活动度减低等症状,而A组未见上述症状。 2.无创肺功能检测气道反应性结果：当乙酰甲胆碱浓度为3.125g/L12.5g/L、25g/L和50g/L时,各组Penh值比较,B组明显高于A组和C组,差异有统计学意义(均P0.05)。 3. BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分比：①BALF细胞计数：B组BALF细胞总数(28.43±3.45)×104/m1,高于A组(9.01±2.33)×104/ml和C组(22.89±4.61)×104/ml (F=46.682, P=0.000)。②BALF嗜酸性粒细胞百分数：B组嗜酸性粒细胞百分比为(22.35±4.91)%,明显高于A组(1.07±0.20)%和C组(13.58±2.13)%(F=71.916,P=0.000)。③BALF淋巴细胞百分数：B组淋巴细胞百分比为(32.32±6.12)%,明显高于A组(10.76±2.02)%和C组(18.50±3.18)%(F=34.688,P=0.000)。 4.肺组织病理学观察：A组小鼠肺组织细支气管和肺泡结构清晰,未见明显炎症浸润；B组小鼠细支气管壁和周围有大量炎症细胞浸润,主要为淋巴细胞,支气管腔内可见粘液分泌,C组小鼠细支气管壁和周围可见炎症细胞浸润,杯状细胞增生,但与哮喘组相比,支气管和血管周围炎症明显减轻。 结论雌性C57BL/6小鼠OVA联合铝剂腹腔注射致敏后,再用OVA雾化激发的方法成功建立小鼠哮喘模型,出现哮喘症状和气道反应性增加,符合哮喘气道炎症的病理生理改变。 第二部分哮喘小鼠肺部Caspase-1表达和IL-1β、IL-33生成 目的观察哮喘小鼠肺部Caspase-1表达和下游细胞因子IL-1β、IL-33的成熟与分泌,探讨可能的机制。 方法取3组动物肺组织标本各3份,1份采用Trizol试剂提取总RNA,逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA),以此为模板行PCR扩增。采用实时荧光定量PCR (real time quantitative-PCR)检测Caspase-1mRNA表达水平；1份加预冷的含蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA裂解液,冰磨3-5min,离心取上清,BCA法测定蛋白含量,绘制标准曲线,计算蛋白浓度,SDS-PAGE电泳和免疫印记反应,半干法转膜,显色,曝光,Image J软件分析；1份用预冷的PBS冲洗后滤纸吸干,称重,剪刀剪碎后,加入PBS液,冰磨2min,离心取上清,BCA法测定蛋白含量,参照试剂盒说明书进行IL-1β、IL-33的检测。 结果 1.小鼠肺组织中Caspase-1mRNA的表达：每个样本的Caspase-1的相对mRNA表达水平直接用样品各自管家基因GAPDH的表达来标准化初始mRNA量。以2-△△Ct值比较,A组(2.12±1.33)和C组(5.99±4.20)均低于B组(15.97±8.67),差异有统计学意义。(F=10.653,P=0.004)。 2.小鼠肺组织Caspase-1蛋白的表达：通过Image J软件分析B组Caspase-1/β-actin (0.56±0.03)较A组(0.47±0.03)和C组(0.28±0.03)明显升高,差异有统计学意义(F=73.916,P=0.000) 3.IL-1p和IL-33的分泌：B组肺组织匀浆上清IL-1β (76.49±9.43) pg/mg及IL-33(73.08±6.67) pg/mg含量均高于A组[(37.51±9.13)pg/mg, P0.05;(32.79±5.92)pg/mg, P0.05)和C组[(64.74±8.65)pg/mg, P0.05;(46.94±2.38)pg/mg, P0.05)。 结论 Caspase-1活化及其下游IL-1家族细胞因子(IL-1β, IL-33)增加并参与哮喘气道炎症。 第三部分脂多糖诱导人气道上皮细胞Caspase-1表达研究 目的观察LPS诱导人气道上皮细胞过程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)表达情况。 方法16HBE细胞复苏后以RPMI-1640(含10%胎牛血清)为基本培养液,0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化传代,每周传代2-3次。2×105/ml接种于6孔细胞培养板培养24h后贴壁,用PBS液和无血清RPMI-1640培养基清洗,37-℃,5%C02培养箱中无血清RPMI-1640培养基培养,用LPS(10μg/ml)预先将16HBE细胞致敏,制备气道上皮细胞哮喘模型,37℃、5%CO2培养箱内培养24h,PBS液为空白对照,LPS组加LPS (10μg/ml)培养24h；LPS+组Caspase-1特异性抑制剂(Ac-YVAD-cmk)(以下简称LPS+cmk组)先用Ac-YVAD-cmk (10μmol/L)预处理,1h后再加入LPS(10μg/ml)培养至24h。四氮唑盐(MTT)法测定各组细胞增殖能力,RT-PCR检查各组细胞Caspase-1mRNA的表达,western blot检测各组细胞Caspase-1蛋白表达,ELISA检测各组细胞上清液中IL-1β的生成。 结果 1.MTT检测及OD值测定：三组人气道上皮细胞MTT检测及OD值测定。阴性对照组OD值为0.57±0.10,LPS组OD值为0.54±0.06,LPS+cmk组OD值为0.51±0.08,各组OD值比较P0.05(P=0.611,F=0.520),各组细胞增殖无显著差异。 2.各组细胞Caspase-1mRNA的表达：以2的-△△Ct次方比较,对照组(1.33±0.33)和LPS+cmk组(1.50±0.24)均低于LPS组(3.11±0.57),各组间差异有统计学意义(F=17.564,P=0.003)。 3.各组细胞Caspase-1蛋白的表达：以灰度扫描结果(Z值)比较,LPS组为0.85±0.11,LPS+cmk组为0.48±0.06,对照组为0.24±0.03。LPS+cmk组与对照组Z值均小于LPS组,差异有统计学意义(F=55.158,P=0.000)。 4.各组细胞上清液IL-1β含量变化：与LPS组[(52.34±2.47) pg/ml]相比,阴性对照组[(15.73±6.83)pg/ml]和LPS+cmk组[(38.15±5.97)pg/ml]均降低,三组间差异有统计学意义(F=46.208P=0.000)。 结论Caspase-1活化参与LPS致人气道上皮细胞炎症过程,并促进下游IL-1p的生成。
【关键词】：小鼠 哮喘 OVA 肺功能 哮喘 Caspase-1 IL-1β IL-33 人气道上皮细胞 Caspase-1 脂多糖IL-1β
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-21
• 参考文献18-21
• 第一部分 小鼠哮喘模型建立21-30
• 1. 材料与方法21-25
• 2. 结果25-27
• 3. 讨论27-29
• 参考文献29-30
• 第二部分 哮喘小鼠肺部Caspase-1表达和L-1β、IL-33的生成30-49
• 1. 材料与方法31-44
• 2. 实验结果44-46
• 3. 讨论46-48
• 参考文献48-49
• 第三部分 脂多糖诱导的人气道上皮细胞Caspase-1表达研究49-58
• 1. 材料与方法50-53
• 2. 实验结果53-55
• 3. 讨论55-57
• 参考文献57-58
• 全文小结58-59
• 综述59-67
• 参考文献63-67
• 攻读学位期间成果67-68
• 致谢68-69

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