Jurkat细胞中STAT4、STAT6及CBP基因沉默在Jak-STATs通路中的相互作用研究

发布时间：2020-05-22 02:22

【摘要】：第一部分超表达STAT4和STAT6稳定Jurkat细胞系的建立 目的:构建STAT4及STAT6超表达Jurkat稳定转染细胞系,以便向该细胞系中转染干扰质粒导致STAT4、STAT6和CBP基因沉默,观察转录因子STAT4、STAT6及CBP在Jurkat细胞中的相互效应。 方法:使用DMRIE-C分别将质粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6转染入Jurkat细胞,并利用质粒编码蛋白中的Neo/Kan酶活性,使用G418筛选出稳定表达STAT4及STAT6的稳定细胞系。 结果:①质粒与DMRIE-C最佳比例随细胞接种密度改变而发生变化。②当接种Jurkat细胞为2.5×105/cm~2时,G418 500 mg/ml为合理的稳定筛选浓度。③在G418筛选下,转染质粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat细胞,其GFP表达高峰分别在转染后第3~4天、第6~7天和第9天出现。④使用脂质体DMRIE-C转染Jurkat细胞,2.5×105/cm~2组与1.5×10~5/cm~2组转染率相差不大。⑤经G418筛选,1.5×105/cm~2组筛出稳定转染的细胞克隆,但是2.5×10~5/cm~2组未筛出。⑥转染质粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat细胞经G418筛选,出现稳定转染的细胞克隆,转染质粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat细胞则未筛选出任何克隆。 结论:经过DMRIE-C转染和G418筛选,发现了质粒表达的一些特点,获得了稳定筛选的一些经验,转染pIRES2-EGFP-STAT6质粒的Jurkat细胞出现了稳定表达的细胞克隆,但转染STAT4质粒的Jurkat细胞因转染率过低未能筛选出稳定细胞系。 第二部分Lipofectamine? LTX转染Jurkat细胞条件的优化 目的:优化阳离子脂质体Lipofectamine? LTX转染悬浮细胞Jurkat的条件,以建立更为有效的转染方案。 方法:把带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的两种质粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-STAT6作为基因载体,采用Lipofectamine? LTX转染Jurkat细胞,检测细胞转染状态、脂质体与DNA的比例、细胞接种密度、不同量培养基等对转染效果的影响,比较瞬时转染效果。 结果:Jurkat细胞生长速度与细胞密度密切相关,转染前1 d换液,可保证细胞的良好生长状态,培养基新鲜度对细胞状态影响不大。Lipofectamine? LTX体积与质粒质量之比为2.75μl:500 ng时,其转染效果明显优于其他各组;适当加大转染时Jurkat细胞的铺板密度,可以明显提高转染试剂的利用率;转染48 h后,300μl/孔组的荧光阳性率是600μl/孔组的(1.4±0.2)倍,差异有统计学意义(P0.05);转染后24 h,各比例组(按照Lipofectamine(?) LTX体积与质粒质量分组)转染效果差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,各比例组转染效果差异显著(P 0.05),且Lipofectamine(?) LTX转染两种质粒效果差异有统计学意义(P0.05)。 结论:对Lipofectamine(?) LTX转染悬浮细胞Jurkat做出了一些建设性意见,并阐述了转染后基因的一些表达规律,以期对悬浮细胞的转染提供相关参考。 第三部分STAT4、STAT6及CBP相应基因沉默在Jurkat细胞中的相互影响观察 目的:利用基因沉默技术,观察由此引起的效应,并分析转录因子STAT4、STAT6及CBP在基因转录之间的相互关系。 方法:使用阳离子脂质体Lipofectamine(?) LTX分别将质粒pGenesil-3-shSTAT4、pGenesil-3-shSTAT6或pGenesil-3-shCBP与检测质粒pGL3-IL-4R和pCAT3-IFN-γ共转染入Jurkat细胞,用IL-12和IL-4激活Jak-STATs信号通路,利用荧光素酶报告基因检测试剂和氯霉素乙酰转移酶ELISA试剂盒检测,观察靶基因的活性。 结果:基因CBP的沉默可以导致基因IL4R和IFNG启动子活性的下降,统计学分析有意义(P0.05);基因STAT4和STAT6的沉默所得结果没有统计学意义(P0.05)。 结论:①CBP是启动基因IL4R和IFNG转录的重要辅助分子;②CBP在Jurkat细胞中的表达是有限的;③在人和小鼠细胞中的CBP结构可能高度保守。④转录因子STAT4和STAT6之间的相互关系暂时无法确定。
【图文】：

向效应亚群 Th1 和 Th2 分化过程中，受调节性转录因子 STATs 的严，STAT6 和 STAT4 分别对 Th2 和 Th1 细胞的增殖和分化具有关键性作效应性和记忆性 Th2 细胞的存活都是必需的[3]。STAT6 基因敲除的 Th2 细胞，且有严重的 IgE 分泌缺陷[11]。活化足够的 STAT6 不但能h2 分化，甚至还会逆转 Th0 细胞向 Th1 分化的趋势[3]。在 STAT4 基内，Th0 细胞缺失了向 Th1 细胞分化的能力，反而显示出向 Th2 细[23]。见表 1-1。由于STAT4和STAT6对Th1和 Th2细胞分化具有的这种举足轻重的时，考虑到 Jurkat 转染率较低，直接将干扰质粒转染入 Jurkat 细胞可理想的统计学数据，因此迫切需要构建 STAT4 和 STAT6 的稳定超表稳定超表达的基础上进行基因沉默，以利于进一步研究。

于 Jurkat 细胞难以转染，，本实验选用了专门用于悬浮细胞、可进行稳定离子脂质体转染试剂——DMRIE-C[25 27]。离子脂质体转染机理[28]：阳离子脂质体与质粒相遇后迅速通过静电作用脂质体结构发生转变, 最终完全包裹住质粒, 形成脂质体-质粒复合体。脂复合体进入细胞的途径目前认为有 3 种模式：与细胞质膜融合方式、细直接渗透。其中，胞吞作用被认为是复合体进入细胞的主要机制。进入质粒从复合物分离出来，启动基因转录并发挥转染效力。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R562.25

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 许吕宏;方建培;翁文骏;徐宏贵;张亚停;;黏着斑激酶基因沉默靶向治疗白血病的实验研究[J];中国实验血液学杂志;2011年03期

2 张娜;钱悦;冯爱平;;RNA干扰分子机制的研究进展及其在黑素瘤中的应用[J];医学综述;2011年10期

3 许吕宏;方建培;王英;翁文骏;;FAK基因沉默增强白血病细胞对化疗药物敏感性[J];中国病理生理杂志;2011年07期

4 李波;刘呈祥;王静;丁兆习;;拉帕替尼和AZD0530联合化疗对PTEN低表达乳腺癌细胞的作用[J];中国现代普通外科进展;2011年06期

5 郭启帅;黄曦;李少林;;沉默PeroxiredoxinⅠ基因增强乳腺癌细胞放射敏感性及其作用机制的实验研究[J];第三军医大学学报;2011年16期

6 罗yN;姚珍薇;杨雅莹;易永芬;;人端粒酶逆转录酶基因沉默对卵巢癌细胞株A2780凋亡的影响及其机制[J];中国生物制品学杂志;2011年07期

7 辛彩霞;左自立;宋本艳;蓝秀;王超;王鸿程;;STAT4与Bax、c-myc在非小细胞肺癌组织中的表达及相关性分析[J];泸州医学院学报;2011年05期

8 王爱丽;吴志宏;徐顺;顾耀辉;黄静;陈波;贾卿;;Smad3基因siRNA表达载体的构建及沉默效应[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年28期

9 王会玲;许烨;张金元;;肌肉萎缩蛋白Fbox-1基因沉默对糖皮质激素作用下肌管萎缩的影响[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2011年01期

10 许乾乾;卫莹;肖卫华;凌斌;周颖;;沉默p53的表达对妇科肿瘤细胞系中STAT3的表达影响[J];中国肿瘤;2011年08期

相关会议论文 前10条

1 谢岷;俞燕;朱珊;贺钰磊;许望琼;曹励之;;HMGB1基因沉默对阿霉素诱导K562/A02细胞凋亡增敏作用的研究[A];中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会论文汇编（上册）[C];2008年

2 高燕;张厚德;杜冀晖;;RNA介导survivin基因沉默对胰腺癌细胞株凋亡及增殖的影响[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（上册）[C];2007年

3 陈岐辉;卢绩;姜凤鸣;王春喜;;HIWI基因沉默对膀胱癌细胞抑制的研究[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年

4 辛佳璇;刘斌;徐春晓;刘贤锡;;S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因沉默抑制乳腺癌MCF-7细胞生长的研究[A];山东生物化学与分子生物学会2009年学术会议论文汇编[C];2009年

5 季爱民;苏丹;车鸥;李文适;孙靓;张忠义;杨彬;;壳聚糖/siRNA纳米粒介导的功能性基因沉默研究(英文)[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

6 李蔚;吴素兰;林q煌;周天鸿;曾志锋;;EGS564基因沉默HCMV UL49表达及其抗病毒活性的研究[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年

7 霍艳英;王莹;张开泰;王莉;项晓琼;胡迎春;徐勤枝;李刚;米粲;吴德昌;;Smad7基因沉默对细胞增殖的影响[A];中国药理学会毒理专业委员会第十次学术会议论文摘要汇编[C];2004年

8 袁诚;李萃;马金;韩成贵;于嘉林;Andrew Jackson;李大伟;;大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默载体系统的改造及其应用[A];中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C];2009年

9 曹雪松;肖奇;周鹏;张晓明;魏春红;李毅;;水稻矮缩病毒编码的基因沉默抑制因子及其作用机制的研究[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文摘要集[C];2005年

10 曹雪松;肖奇;周鹏;张晓明;魏春红;李毅;;水稻矮缩病毒编码的基因沉默抑制因子及其作用机制的研究[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文集[C];2005年

相关重要报纸文章 前10条

1 肖嵘　苏玉文 湛意;将基因沉默理论用于硬皮病[N];健康报;2007年

2 余志平;siRNA治疗研究异彩纷呈(上)[N];中国医药报;2007年

3 实习生 吴丽华;周雪平：8亿农民让我留在国内[N];科技日报;2006年

4 本版编辑 颜亮 楚君　任海军;“沉默”是金[N];医药经济报;2006年

5 记者 高博;胚胎干细胞分化方式被确定[N];科技日报;2008年

6 聂翠蓉编译;RNAi：生物技术的蓝月亮[N];科技日报;2003年

7 肖兵;攻关锁定害虫抗药性、作物抗病性[N];农资导报;2007年

8 谷文;百奥迈科与Benitec开发新型小核酸干扰抗乙肝药物[N];中国医药报;2009年

9 医学博士 科学松鼠会成员 致桦;美丽的干扰[N];中国经营报;2010年

10 记者：刘莉 实习生：吴丽华;从“根”上给农作物“治病治虫”[N];科技日报;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 李洪海;应用RNAi技术对肝癌癌基因p28～(GANK)生物学功能的研究[D];第二军医大学;2004年

2 吕典秋;马铃薯纺锤块茎类病毒遗传多样性及其诱导的基因沉默[D];东北农业大学;2009年

3 牛胜鸟;病毒基因介导的抗性机制及抗病毒转基因西瓜的研究[D];中国农业大学;2004年

4 陶小荣;中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）致病分子机理及其卫星DNA诱导的基因沉默研究[D];浙江大学;2004年

5 徐凯成;利用RNA干扰抑制人肝癌细胞N-ras表达的研究[D];吉林大学;2006年

6 张华建;三种激发子诱导的过敏性细胞死亡和气孔关闭的分子机制研究[D];南京农业大学;2009年

7 张新民;原沉默子及染色质重构蛋白对基因沉默和异染色质结构的作用[D];吉林大学;2011年

8 王成勤;Kif2a基因沉默抑制舌鳞状细胞癌生长转移的研究[D];山东大学;2011年

9 邓绪芳;p53在日本脑炎病毒复制及其致病性中的作用[D];中国农业科学院;2011年

10 王长春;番茄Cf-4和Cf-9基因介导的过敏性反应调控及基因沉默技术的研究[D];浙江大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 牛超;Jurkat细胞中STAT4、STAT6及CBP基因沉默在Jak-STATs通路中的相互作用研究[D];重庆医科大学;2011年

2 任s

本文编号：2675297