黄芩苷抗结核作用及机制研究

发布时间：2017-03-25 19:03

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【摘要】：目的结核病是一古老的疾病,从古至今,人类一直未曾停止与其不懈的斗争。自上世纪40年代链霉素应用于结核病治疗,以及随后一线抗结核药利福平、异烟肼及乙胺丁醇的应用,人类对结核病的控制才有了突破性进展。抗结核药的广泛应用以及不正规治疗必然伴随细菌耐药性的产生,从最初单耐药发展到多耐药,甚至耐多药及泛耐药。近年来HIV与结核的双重感染急剧上升,面临HIV疫情及耐药结核的威胁,抗结核新药的研发迫在眉睫。中药黄芩苷是药用植物黄芩的黄酮类化合物,目前已研究其有多种疗效。基于目前结核耐药形势及抗结核药物毒副作用,本课题借助体外抑菌试验及形态学观察,以期明确黄芩苷的抗结核作用及机制,为中西医结合治疗结核病开拓思路,提供基础实验数据,并为进一步的临床推广打下基础。 方法利用绝对浓度法进行体外黄芩苷单药抑菌试验,求得黄芩苷MIC,评估黄芩苷的抗结核作用；利用棋盘法,将不同浓度梯度黄芩苷分别与不同浓度梯度的利福平、异烟肼及乙胺丁醇交叉进行联合抑菌试验,通过绝对浓度法求得FIC,评估黄芩苷与抗结核药物的联合效应。以荧光试剂5(6)-羧基-四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯标记黄芩苷,荧光标记黄芩苷进行体外抑菌试验,评价标记前后黄芩苷的抑菌作用有无变化,制备药理活性的荧光探针；激光扫描共聚焦显微镜对标记黄芩苷作用后的结核菌进行扫描及三维重建,观察荧光标记黄芩苷抗结核菌作用的部位。 结果108例黄芩苷体外抑菌试验结果表明,黄芩苷对结核分枝杆菌有明确抑制作用,MIC值在0.75～12mg/ml之间,MIC为12mg/ml的菌株占8.33%,6mg/ml的菌株占45.87%,3mg/ml的菌株占37.62%,1.5mg/ml的菌株占6.48%,0.75mg/ml的菌株占0.93%,MIC50和MIC90均为6mg/ml。黄芩苷与INH、RFP、EMB的联合药敏试验结果表明,黄芩苷与INH、RFP的联合效应主要表现为协同或相加,与EMB的联合效应主要表现为拮抗。荧光标记黄芩苷抑菌试验结果表明,其MIC降低1个浓度梯度。LSCM观察结果提示标记黄芩苷进入结核菌内部发挥作用,而非仅粘附于结核菌表面。结“CT式”断层扫描及三维重建结果,荧光标记黄芩苷作用部位为结核菌细胞质,抗结核作用可能与影响核酸代谢,干扰基因表达及蛋白质合成有关。 结论黄芩苷体外抑菌试验确定黄芩苷的抗结核作用,MIC值在0.75～12mg/ml之间,MIC为12mg/ml的菌株占8.33%,6mg/ml的菌株占45.87%,3mg/ml的菌株占37.62%,1.5mg/ml的菌株占6.48%,0.75mg/ml的菌株占0.93%,MIC50和MIC90均为6mg/ml。黄芩苷对结核分枝杆菌的直接抑制作用可能与其黄酮环的烯烃结构有关,糖苷成分的改变也可能影响其抑菌活性。黄芩苷与INH、RFP及EMB的联合药敏试验结果表明,黄芩苷与INH、RFP的联合效应主要表现为协同或相加,与EMB的联合效应主要表现为拮抗。说明黄芩苷能够部分降低INH、RFP的耐药性,降低药物所需剂量,降低毒副作用,避免及延缓耐药的发生；机制可能与影响已知耐药靶基因,外排泵基因等有关。黄芩苷不能降低EMB的耐药程度,反而进一步增加其耐药性,增加其使用剂量,更易诱发毒副作用；机制可能与竞争抑制作用或影响己知耐药靶基因,外排泵基因及新的药物靶基因有关。荧光标记黄芩苷抑菌试验结果表明,其MIC降低1个浓度梯度,提示抗结核活性增强,推测有以下可能：1.氨基的加入增加了黄芩苷的抑菌活性2.黄酮类化合物结构中糖苷成分的存在易削弱其活性,氨基和5-(6)TAMRA SE的加入,可能削弱了葡萄糖苷键的稳定性,从而增加标记黄芩苷的抑菌活性3.黄芩苷的抑菌活性基团可能不止黄酮环的烯烃结构,或许也与黄芩苷的6位羰基有关。LSCM观察结果提示,标记黄芩苷进入结核菌内部发挥作用,而非仅粘附于结核菌表面。结合“CT式”断层扫描及三维重建结果,荧光标记黄芩苷作用部位为结核菌细胞质,抗结核作用可能与影响核酸代谢,干扰基因表达及蛋白质合成有关。
【关键词】：黄芩苷 结核分枝杆菌 MIC FIC 5-(6)TAMRA SE 荧光标记 LSCM
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R285;R521
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 缩略语12-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、黄芩苷单药体外抑菌试验16-24
• 1.1 仪器与材料16-17
• 1.1.1 结核分枝杆菌16
• 1.1.2 试剂16
• 1.1.3 仪器16
• 1.1.4 改良罗氏固体培养基16-17
• 1.2 方法17-20
• 1.2.1 临床痰标本的初分离培养17-18
• 1.2.2 结核分枝杆菌的临床常规药敏试验18-19
• 1.2.3 黄芩苷体外抑菌试验19-20
• 1.3 统计学分析20
• 1.4 结果20-21
• 1.4.1 108例黄芩苷单药抑菌MIC20-21
• 1.5 讨论21-23
• 1.6 小结23-24
• 二、黄芩苷联合抗结核药体外抑菌试验24-33
• 2.1 仪器与材料24-25
• 2.1.1 结核分枝杆菌24
• 2.1.2 试剂24
• 2.1.3 仪器24-25
• 2.1.4 改良罗氏固体培养基25
• 2.2 方法25-28
• 2.2.1 联合药敏培养基的制备25-27
• 2.2.2 接种27-28
• 2.3 统计学分析28
• 2.4 结果28
• 2.4.1 黄芩苷联合抗结核药药敏试验的FIC指数28
• 2.5 讨论28-31
• 2.6 小结31-33
• 三、黄芩苷抑菌机制初步研究33-46
• 3.1 黄芩苷荧光标记33-36
• 3.1.1 仪器与材料34-35
• 3.1.2 方法35-36
• 3.2 荧光标记黄芩苷的LSCM观察36-37
• 3.2.1 仪器与材料36-37
• 3.2.2 方法37
• 3.3 结果37-43
• 3.3.1 荧光标记黄芩苷的检测及分离纯化37-39
• 3.3.2 乙酸乙酸钠缓冲液溶解黄芩苷的抑菌活性结果39
• 3.3.3 荧光标记黄芩苷的抑菌活性39
• 3.3.4 荧光标记黄芩苷作用结核菌的激光共聚焦显微镜观察39-40
• 3.3.5 荧光标记黄芩苷在结核菌内的定位分析40-43
• 3.4 讨论43-45
• 3.4.1 黄芩苷的荧光标记43-44
• 3.4.2 乙酸乙酸钠缓冲液溶解黄芩苷的抑菌活性44
• 3.4.3 荧光标记黄芩苷的抑菌活性44-45
• 3.4.4 荧光标记黄芩苷作用结核菌的激光共聚焦显微镜观察45
• 3.4.5 荧光标记黄芩苷在结核菌内的定位分析45
• 3.5 小结45-46
• 结论46-47
• 参考文献47-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述54-64
• 黄芩苷作用及机制研究进展54-60
• 综述参考文献60-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨慧媛;宋育林;许建明;;抗结核药物肝毒性研究现状及其存在的问题[J];安徽医药;2008年04期

2 郁美娟,张海凤,赖奕坚,孟庆华,张万斌;新型罗丹明类荧光标记探针的研究(Ⅱ)——罗丹明B-N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成与标记应用[J];染料与染色;2004年05期

3 姬亚昆;凌均h

本文编号：267617