辅助性T淋巴细胞亚群-17在过敏性哮喘发病中的作用

发布时间：2020-05-25 14:18

【摘要】：支气管哮喘是一种难治性的呼吸道疾病,具有病程长,易反复的特点,极大的影响了患者的生活质量。它由多种细胞包括炎性细胞和结构细胞(如T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、气道上皮细胞等)以及细胞组分参与,表现为气道慢性炎症、气道重塑、粘液分泌增多以及气道高反应性。其中,T淋巴细胞是哮喘发病的重要炎症细胞,也是必不可少的免疫细胞。根据表面抗原的不同,T淋巴细胞可以分为CD4+T和CD8+T细胞,CD4+T细胞按照产生细胞因子的不同又可以分为辅助性T细胞(Helper T cell, Th)1和Th2细胞亚群。目前认为哮喘的发病机制与Th1/Th2这两个功能亚群及其产生的细胞因子失衡相关。近年来研究发现了一类新的辅助性T淋巴细胞Th17,它是独立于Th1和Th2存在的。它的发现,打破了以往经典的Th1/Th2模式,并为我们研究哮喘的发病机制提供了新的理论依据。已有研究表明：Th17细胞以及其相关的细胞因子参与了哮喘的发生发展,然而这些研究仅局限于动物模型或哮喘患者局部气道炎症,对哮喘患者Th17免疫的全身性表现的研究尚不多见。然而哮喘不仅是局部而且也是全身系统性的免疫炎症反应,所以过敏性哮喘患者可能也存在着异常的全身系统性Th17免疫。本研究旨在探讨过敏性哮喘患者是否存在异常的全身性Th17免疫反应,如存在则在不同严重程度哮喘患者之间是否有差别,以及Th17相关细胞因子在哮喘发病中所起作用。首先,在细胞和蛋白水平,利用流式细胞术以及酶联免疫吸附剂测定方法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和Luminex方法检测了过敏性哮喘组和健康对照组外周血中Th1、Th2和Th17细胞比例以及其相关因子[干扰素-γ(Interferon, IFN-γ)、白介素(Interleukin, IL)-4、IL-17、IL-22、IL-23和IL-25]的分泌水平,结果发现：哮喘患者外周血中Th17细胞亚群及相关细胞因子IL-17、IL-22和IL-23的含量均高于健康对照组,并且随病情严重程度增高而增加,Th1/Th2细胞亚群和其细胞因子比例均低于健康对照组,即使一些哮喘患者接受过吸入激素的治疗。我们发现血浆和培养液上清中IL-17的水平与IL-23的含量呈正相关,提示IL-23可能对于Th-17的分化具有促进作用。同时,实时荧光定量PCR(Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)分析也发现Th17的关键性转录因子维甲酸相关孤儿核受体(Retinoic acid-related orphan receptorγt, RORγt)在过敏性哮喘组是显著升高的,从另一方面提示哮喘患者存在着异常的Th17免疫。另外,IL—25是IL—17家族中的成员之一,但是和IL—17在哮喘中所起的作用却不尽相同。将过敏性哮喘组按照病情严重程度分级后发现,IL—17水平在重度哮喘患者最高,并且不受吸入激素的影响；而IL—25仅在轻度哮喘患者升高,说明这两个细胞因子和哮喘疾病的严重程度之间可能存在着一定的联系,在哮喘发病中扮演着不同的角色。为进一步研究IL—25在哮喘发病中的作用,我们在体外用IL—25分别刺激哮喘患者和健康人的外周血单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells, PBMC),比较其分泌合成相关细胞因子的水平的差别。结果发现,IL-25可以剂量依赖性地诱导哮喘患者PBMC合成分泌IL-4；相反,IL-25对IL-17的分泌具有抑制作用,但量效关系不明显,综上,Th17在哮喘疾病的发生发展中起到重要作用,是对经典的Th1/Th2模式的重要补充,可能为非Th2免疫为主型哮喘的发病机制以及治疗提供新的理论依据。第一部分Th17细胞在过敏性哮喘患者中的作用目的：检测Th17细胞亚群免疫在过敏性哮喘发病中的作用。方法：分别采集过敏性哮喘组(n=29)和健康对照组(n=12)外周血,并分离出外周血单个核细胞(PBMC)。采用流式细胞仪技术检测外周血中Th1,Th2和Th17细胞亚群的含量。应用酶联免疫吸附剂测定方法(ELISA)和Luminex检测过敏性过敏性哮喘组组和健康对照组血浆和细胞培养液上清中Th1细胞因子干扰素-γ(IFN-γ),Th2细胞因子白介素-4(IL-4)以及Th17免疫相关的细胞因子IL-17,IL-22,IL-23和IL-25的水平。采用实时定量PCR (RT-PCR)方法检测Th17分化的主要转录因子维甲酸相关孤儿核受体-γ(ROR-γt)在PBMC中核酸水平的表达。结果：1、过敏性哮喘组外周血Th1/Th2细胞亚群的含量和Th1/Th2细胞因子比例(IFN-y/IL-4)均低于健康对照组(p0.05)。2、过敏性哮喘组外周血Th2和Th17细胞亚群含量、血浆和细胞培养液上清中相关细胞因子(IL-4、IL-17、IL-22和IL-23)的水平均高于健康对照组(p0.05),即使一些过敏性哮喘的患者接受过吸入激素治疗。3、将过敏性哮喘组按照病情严重程度分级后发现：血浆中Th17细胞亚群含量以及IL-17和IL-22的水平均随哮喘程度加重而增高,IL-25仅在轻度哮喘患者中升高。4、对Th17相关细胞因子以及其与Thl和Th2细胞因子进行相关分析后发现：血浆中和细胞培养液上清中IL-17和IL-23水平均呈正相关(r=0.526,p=0.003和r=0.428,p=0.021),而其他细胞因子之间未发现有明显的相关性。5、过敏性哮喘组PBMC中ROR-γt核酸水平的表达高于健康对照组(p0.05)。结论：以上结果表明除了Th1/Th2免疫失衡以外,异常的Th17细胞免疫以及Th17相关细胞因子可能也参与了过敏性哮喘的发病。第二部分IL-25对过敏性哮喘患者PBMc合成分泌IFN-γ、IL-4和IL-17水平的影响目的：观测IL-25对过敏性哮喘患者和健康人体外培养PBMC合成分泌IFN-γ、IL-4和IL-17水平的影响。方法：分别采集过敏性哮喘患者组(n=29)和健康对照组(n=12)外周血,并分离出外周血单个核细胞(PBMC)。将两组的PBMC分别分成无干预培养组、PMA+Ionomycin刺激组、IL-25单独刺激组以及IL-25(50 ng/ml)+PMA+Ionomycin共刺激组分组培养,收集各组的细胞培养液上清。并采用不同梯度浓度的IL-25来协同刺激PBMC。应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞培养液上清中Thl细胞因子IFN-γ,Th2细胞因子IL-4以及Th17细胞因子IL-17的水平。结果：1、无干预自发培养条件下和IL-25单独刺激情况下,过敏性哮喘组和健康对照组培养液上清中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量均不能检测出。PMA+Ionomycin刺激后,和健康对照组相比,过敏性哮喘组PBMC分泌IL-4和IL-17的水平有所升高(P0.05),而IFN-γ的含量在两受试组之间无显著性差异(p0.05)。在联合IL-25 (50 ng/ml)+PMA+Ionomycin共刺激的条件下,哮喘患者和健康人PBMC合成分泌IL-4的水平均有所升高,且哮喘患者比健康人升高幅度更明显(P0.05)。IL-25对正常人的PBMC合成分泌IFN-γ和IL-17无明显抑制作用(p0.05),但在哮喘患者,IL-25可以抑制IL-17的分泌(P0.05)。2、IL-25在一定浓度范围内(1 ng/ml—50 ng/ml)可以促进PMA+Ionomycin刺激的过敏性哮喘患者的PBMC分泌IL-4,且具有剂量依赖关系,在50 ng/ml时达最大效应；而IL-25对过敏性哮喘患者PBMC合成分泌IL-17抑制作用的无明显量效关系。结论：IL-25可以诱导过敏性哮喘患者PBMC合成分泌IL-4水平的增加和IL-17水平的减少,并且在一定范围内,IL-25刺激PBMC分泌IL-4具有一定的量效关系。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R562.25

【参考文献】