哮喘小鼠气道上皮TSLP表达及激活DCs加重气道炎症的研究

发布时间：2020-05-28 17:57

【摘要】： 目的：支气管哮喘是一种气道慢性炎性疾病,本质上是一种由多种炎症细胞、炎性介质和细胞因子网络共同参与的慢性气道变应性炎症,以嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞浸润为特征。支气管哮喘的发病率呈逐年上升趋势,严重威胁着公众健康,其主要病因和发病机制尚不明确,是目前研究的热点。一般认为在遗传易感人群中,由正常环境变应原引起的不适当免疫应答,导致哮喘气道炎症的发生与发展。传统认为气道上皮仅仅是构成气道内外环境的生理屏障,通过其粘液纤毛系统和机械屏障作用在气道防御中起重要作用。近年来随着对哮喘发病机制的深入研究,发现气道上皮不仅是气道的物理屏障,而且在气道固有免疫和获得性免疫反应的起始、维持和调节中起着重要作用。哮喘发病过程中,内、外源性因素(生物、物理、化学及变态反应等)反复刺激哮喘患者气道上皮,引起上皮损伤,释放一系列的炎症介质、细胞因子和趋化因子等,参与哮喘慢性气道炎症的启动、持续和气道重塑过程,并与哮喘的病理生理表现如气道阻塞和气道高反应性密切相关。近年来,研究发现TSLP (Thymic stromal lymphopoietin,胸腺间质淋巴细胞生成素)是一种气道上皮分泌的细胞因子,以特有方式激活DC,并诱导CD4+T细胞向Th2分化发育,是过敏性炎症发生的一种主要启动因子,在过敏性疾病发生中起重要作用。大量研究证实,TSLP在哮喘患者气道中表达增加,而且TSLP的表达量与聚集Th2的化学因子以及病情的严重程度相关,TSLP促使Th0细胞向Th2细胞分化,导致Th2炎症因子释放增加,加重气道炎症,在哮喘发病中有重要意义。我们试图通过建立小鼠哮喘模型,观察气道上皮TSLP在转录和蛋白水平的表达,探讨TSLP在哮喘发病中的作用及加重哮喘气道炎症的机制,从而更加深入明确哮喘的病因和发病机制。方法：雌性BALB/c小鼠30只,随机分为生理盐水对照组、哮喘模型组和TSLP抗体干预组,每组10只。用卵白蛋白(OVA)致敏与激发建立小鼠哮喘模型；测定小鼠的气道反应性；苏木素伊红(HE)染色观察小鼠肺组织病理变化；收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),酶联免疫吸附试验(ELISA)检测对照组和哮喘组小鼠BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的含量；实时定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)法测定肺组织TSLPmRNA的表达；免疫组化及免疫印迹(Western blot)法测定肺组织中TSLP蛋白的表达；流式细胞术检测BALF中树突状细胞(DCs)表面CD40、CD80、CD86的表达。TSLP抗体干预组,进一步采用流式细胞术检测BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86的表达, ELISA法测定BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的含量。统计学分析：所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0软件进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。P0.05表示有统计学意义,P0.01表示有显著统计学意义。免疫组化图片采用Image-prol-plus软件分析。结果： 1.小鼠造模成功的临床表现以小鼠出现明显的烦躁不安,活动频繁,呼吸急促,腹肌抽搐,大、小便失禁,毛发竖起,部分小鼠出现反应迟钝,动作迟缓等为诱喘成功的标志。 2.小鼠气道反应性的测定对照组与OVA组小鼠呼气阻力基础值之间无差异,注射乙酰甲胆碱(mAch)激发后,OVA组小鼠呼气阻力较对照组明显增高(P0.05),表明哮喘小鼠的气道反应性显著高于对照组小鼠,哮喘模型制备成功。 3.HE染色观察小鼠气管和肺组织病理学改变对照组小鼠气道上皮结构完整,粘膜下少量炎症细胞浸润；OVA组小鼠气道上皮脱落,粘膜下大量炎性细胞浸润和腺体增生。对照组肺组织结构清晰,肺泡壁结构完整,气道周围少量炎症细胞浸润；OVA组支气管上皮脱落,肺泡壁明显增厚,血管及支气管周围以嗜酸性粒细胞为主的大量炎性细胞浸润。 4.免疫组化检测肺组织内TSLP的表达水平对照组可见TSLP表达较弱,支气管上皮仅见少量表达；OVA组可见支气管上皮及肺泡上皮上存在大量被染成褐色TSLP阳性免疫反应,表达明显强于对照组。 5.小鼠BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的表达水平与对照组相比,OVA组BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的表达水平明显增高,两组间差异具有统计学意义(P0.05)。 6. TSLP mRNA在肺组织的表达水平 OVA组肺组织中TSLP mRNA表达强度较对照组显著增强,两组间差异具有统计学意义(P0.05)。 7.肺组织中TSLP蛋白的表达水平 OVA组肺组织中TSLP蛋白的表达水平较对照组显著增强,两组间差异具有统计学意义(P0.05)。 8.BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86分子的表达水平与对照组相比,OVA组BALF中DCs表面CD40、CD80和CD86分子表达增强,两组间差异具有统计学意义(P0.05)。 9.TSLP mRNA表达强度与BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平相关性分析 OVA组TSLP mRNA的表达与BALF中IL-4、IL-5和IL-13的水平均明显升高,直线相关Pearson分析,TSLP和IL-4呈正相关(r=0.989,p0.01),TSLP和IL-5呈正相关(r=0.996,p0.01),TSLP和IL-13呈正相关(r=0.998,p0.01) 10.TSLP抗体干预的作用 TSLP抗体干预组,肺组织中TSLPmRNA的表达较OVA组降低,但与对照组相比无差异(P0.05)；BALF中DCs表面CD40、CD80、CD86分子的表达较OVA组降低,但与对照组相比无差异(P0.05),进一步检测BALF上清中IL-4、IL-5和IL-13的水平,发现IL-4、IL-5和IL-13的表达水平较OVA组降低,但与对照组相比无差异(P0.05)。结论： 1.TSLP在哮喘小鼠动物模型气道上皮及肺组织内特异性高表达。 2.TSLP通过激活DCs,诱导CD4+T细胞向Th2分化发育启动Th2型细胞应答,从而加重哮喘气道炎症。 3.TSLP抗体干预可阻断DCs的活化,减少Th2细胞因子的分泌,从而减轻哮喘炎症反应。气道上皮可能是哮喘气道免疫、炎症和重塑发生根源的理论基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R562.25

【参考文献】