ATF3通过AP-1调控香烟烟雾诱导的气道粘液高分泌

发布时间：2017-03-26 10:15

  本文关键词：ATF3通过AP-1调控香烟烟雾诱导的气道粘液高分泌，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：众所周知,粘液的过表达是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的重要病理特征。研究表明,香烟烟雾(cigarette smoke,CS)暴露与COPD的发生发展关系密切。气道粘液的过度分泌可引起气道阻塞,从而导致肺功能下降。转录激活因子3(Activating transcription factor3, ATF3)是一种参与细胞反应过程的适应性反应基因。研究显示其对炎症反应具有双向调节作用,通过调节不同的靶基因从而加强或抑制炎症反应,机体会根据应激条件的性质(如应激的类型和持续的时间)和应激信号影响靶组织/细胞类型的不同而发生不同的反应。据报道,气道粘液的过表达也是气道炎症反应的一种表现形式。然而,迄今为止国内外尚未有研究探讨气道上皮细胞中ATF3的表达在调控香烟烟雾诱导的气道粘液分泌中的作用。 目的：本课题拟探讨ATF3是否参与调控COPD中MUC5AC(气道粘液的一种重要组成成分)的表达,并探索其机制。 方法：检测香烟烟雾暴露对人体气道上皮细胞HBE(正常气道上皮细胞系),NCI-H292细胞(人肺粘液表皮样癌来源细胞系)和MTEC(小鼠原代气道上皮细胞)的ATF3和MUC5AC的表达影响。利用ATF3小干扰RNA(ATF3small-interfering RNA, ATF3siRNA)和ATF3过表达质粒探讨ATF3是否与香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达有关。利用实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, Q-PCR),蛋白质印迹法(Western Blot, WB)和免疫荧光(immunofluorescence, IF)检测ATF3的缺失或过表达是否影响香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达。进一步利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)及染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, CHIP)法验证假设,即ATF3是否通过激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)间接结合到MUC5AC启动子区域从而调控其表达。在体内研究中,我们用通过CSE气道滴注和熏烟制造ATF3基因敲除小鼠(ATF3-/-mice)的COPD模型,从而验证ATF3是否参与调控香烟烟雾诱导的气道粘液的表达。 结果： 1.体外实验中,香烟烟雾能显著地诱导气道上皮细胞HBE, NCI-H292和MTEC中ATF3和MUC5AC的表达。当用ATF3siRNA特异性地敲除ATF3这个基因后,香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达显著下降,而白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-8(interleukin-8, IL-8)的表达明显增高。然而,ATF3过表达质粒未对香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达产生明显影响。这一现象提示,ATF3可能并非直接调控MUC5AC的表达。Co-IP和CHIP实验结果证实ATF3通过AP-1信号通路作用于MUC5AC的启动子区域,从而间接调控香烟烟雾诱导的气道MUC5AC的表达。 2.体内实验中,CSE气道滴注野生型小鼠(Wild Type mice, WT mice)大气道MUC5AC的表达较对照组明显升高,然而在ATF3-/-小鼠中气道MUC5AC的表达并未明显下降。这和体内的结果并不一致。然而,在ATF3-/-小鼠模型组中,气管及血管周围中性粒细胞的浸润明显增加。(体内模型需进一步参照熏烟小鼠的结果)。 结论：本研究结果提示ATF3通过AP-1促进香烟烟雾诱导的气道MUC5AC的表达,同时ATF3能抑制香烟烟雾诱导的IL-6, IL-8的表达。ATF3在调节COPD气道粘液高分泌和炎症反应中具有重要作用,研究结果为临床的靶向治疗提供重要参考。
【关键词】：转录激活因子-3 MUC5AC 香烟烟雾 激活蛋白-1 白介素-6 白介素-8
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.9
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩略语中英文对照11-12
• 目次12-14
• 第一章 引言14-16
• 第二章 材料与方法16-43
• 2.1 香烟烟雾提取物16
• 2.2 实验动物16
• 2.3 使用的主要实验仪器与设备16-17
• 2.4 实验试剂与材料17-23
• 2.4.1 实验试剂与材料17-19
• 2.4.2 实验试剂配制19-23
• 2.5 实验方法23-43
• 2.5.1 细胞培养23
• 2.5.2 siRNA转染23-24
• 2.5.3 质粒转染24-25
• 2.5.4 细胞总mRNA的提取及组织总mRNA的提取25-27
• 2.5.5 cDNA的合成及Q-PCR过程27-29
• 2.5.6 Western Blot29-31
• 2.5.7 免疫荧光31-33
• 2.5.8 免疫共沉淀(IP)33-34
• 2.5.9 染色质免疫共沉淀(CHIP)34-39
• 2.5.10 小鼠原代气道上皮细胞(MTEC)培养39-41
• 2.5.11 构建小鼠CSE气道滴注模型41
• 2.5.12 构建小鼠熏烟3月模型41-42
• 2.5.13 动物处理及标本收集42
• 2.5.14 统计学分析42-43
• 第三章 研究结果43-58
• 3.1 香烟烟雾能诱导气道上皮细胞MUC5AC的分泌43-44
• 3.2 香烟烟雾能诱导气道上皮细胞ATF3的表达44-46
• 3.3 特异性敲除ATF3能下调香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达46-48
• 3.4 ATF3过表达对香烟烟雾诱导的MUC5AC高表达无影响48-50
• 3.5 特异性敲除ATF3能上调香烟烟雾诱导的IL-6,IL-8的表达50
• 3.6 香烟烟雾能激活ATF3-AP-1信号通路50-54
• 3.7 体内实验中,ATF3的缺失并不能缓解香烟烟雾引起的气道MUC5AC的分泌54-58
• 第四章 讨论58-60
• 第五章 结论60-61
• 参考文献61-64
• 综述64-75
• 参考文献70-75
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果75

【共引文献】

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