Sirt1在慢性阻塞性肺疾病大鼠内皮祖细胞功能及作用机制研究

发布时间：2020-05-29 14:11

【摘要】：一、COPD大鼠外周血EPCs功能变化目的复制COPD大鼠模型,提取大鼠外周血EPCs体外培养并鉴定,观察COPD对EPCs增殖、黏附、迁移、周期和凋亡功能的影响。方法应用熏烟联合气管注入内毒素干预健康雄性SD大鼠复制COPD模型,通过对肺泡灌洗液炎症细胞计数和肺组织病理染色判断COPD模型是否构建成功。腹主动脉采血后用密度梯度离心法从大鼠外周血中获取单个核细胞,将其接种在加有细胞载玻片的六孔板上,应用EBM-2专用培养基培养细胞,待细胞贴壁分化后,通过FITC标记的UEA-1的吸附和内吞Dil-ac-LDL鉴定细胞。应用CCK-8试剂盒鉴定EPCs增殖和黏附功能,应用transwell观察细胞迁移功能,应用流式细胞仪检测EPCs周期和凋亡情况。数据统计用SPSS.20统计软件包对数据进行分析,数据以(?)±s表示,组间比较采用t-test,P0.05代表差异有统计学意义。结果通过烟熏联合注射LPS方法,肺泡灌洗液炎细胞计数和病理结果证明COPD大鼠模型成功复制;经FITC标记的UEA-1的吸附和内吞Dil-ac-LDL鉴定出分离培养细胞的为EPCs。通过CCK-8方法测得COPD大鼠组EPCs的增殖能力较对照组显著降低(P0.01);黏附实验测得COPD组EPCs的黏附能力较对照组显著降低(P0.01);transwell测得COPD组EPCs的迁移能力较对照组显著降低(P0.00);COPD组较对照组G_0G_1期EPCs显著增多(P0.01),S期和G_2M期EPCs显著减少(P0.01;P0.05);COPD组EPCs凋亡率明显高于对照组(P0.05)。结论COPD大鼠外周血中EPCs增殖,迁移、粘附功能降低,细胞周期多阻滞在G_0G_1期,S期和G_2M期细胞减少,细胞凋亡率显著增加。二、Sirt1对EPCs增殖、迁移、黏附、周期及凋亡的影响第一节EPCs表达Sirt1目的明确Sirt1在EPCs中表达。方法体外培养COPD大鼠组及对照组外周血EPCs,通过PCR、Westernblot及细胞免疫荧光的方法测定EPCs表达Sirt1。数据统计用SPSS.20统计软件包对数据进行分析,数据以(?)±s表示,组间比较采用t-test,P0.05代表差异有统计学意义。结果COPD大鼠EPCs上Sirt1mRNA的表达显著低于对照组细胞(P0.01)。COPD组和对照组EPCs细胞均可检Sirt1蛋白条带,经WCIF ImageJ图像分析软件分析,以β-actin标化后的COPD大鼠细胞Sirt1蛋白表达强度显著低于对照组细胞(P0.01)。COPD大鼠和对照组Sirt1在共聚焦显微镜下观察:两组细胞均表达Sirt1,Sirt1在COPD大鼠荧光强度显著低于对照组。结论Sirt1在COPD组及对照组EPCs内均有表达,且COPD组显著低于对照组。第二节Sirt1对EPCs增殖、迁移、黏附、周期及凋亡的影响目的观察Surt1对EPCs增殖、黏附、迁移、周期和凋亡功能的影响。方法应用Sirt1的激动剂(SRT1720)和携有Sirt1病毒慢病毒的转染EPCs方法使Sirt1过表达称为激动剂组,应用Sirt1抑制剂(EX527)降低EPCs内Sirt1表达称为抑制剂组,应用CCK-8试剂盒鉴定EPCs增殖和黏附功能,应用并通过transwell小室观察细胞迁移功能,应用流式细胞仪检测EPCs周期和凋亡情况。数据统计用SPSS.20统计软件包对数据进行分析,数据以(?)±s表示,组间比较采用t-test,P0.05代表差异有统计学意义。结果激动剂和携带Sirt1慢病毒转染提高Sirt1表达后EPCs增殖能力较COPD组显著增加(P0.05;P0.05),抑制剂组增殖能力较COPD组显著降低(P0.05)。激动剂组EPCs的黏附能力较COPD显著增加(P0.01),抑制剂组黏附能力较COPD组降低,但是没有统计学意义(P0.05)。激动剂组EPCs的迁移能力较COPD显著降低(P0.0001),抑制剂组迁移能力较COPD组显著降低(P0.001)。激动剂组较COPD组G_0G_1期EPCs显著减少(P0.001),S期和G_2M期EPCs显著增多(P0.01;P0.01),抑制剂组较COPD组G_0G_1期EPCs显著增加(P0.05),S期和G_2M期EPCs减少,但是没有统计学意义(P0.05;P0.05)。激动剂组EPCs凋亡率较COPD组显著降低(P0.05),抑制剂组EPCs凋亡率较COPD组显著增高(P0.01)。结论Sirt1过表达时对EPCs增殖、黏附、迁移功能具有促进作用,细胞凋亡减少,Sirt1表达降低时会抑制EPCs增殖、黏附、迁移功能具有促进作用,细胞凋亡增加。三、Sirt1对NF-KB,FOXO3a,P53基因的影响目的通过改变Sirt1表达后观察COPD大鼠的EPCs Sirt1、FOXO3a、p53及NF-kB的表达,并观察COPD和对照大鼠肺组织内Sirt1及FOXO3a,p53,NF-kB的表达,探讨Sirt1和FOXO3a、NF-KB、P53之间的关系。方法提取对照组、COPD组、激动剂组和抑制剂组EPCs的mRNA、蛋白质通过qPCR方法和蛋白印迹方法检测EPCs内Sirt1、FOXO3a、NF-KB及P53的表达,并制备细胞爬片,通过免疫荧光的方法观察Sirt1在EPCs的表达。将复制成功的COPD大鼠和正常组大鼠肺组织取出后分别提取RNA、蛋白质和制成石蜡包块;通过qPCR方法、蛋白印迹方法和免疫荧光的方法检测肺组织内Sirt1、FOXO3a、NF-KB及P53的表达。数据统计用SPSS.22统计软件包对数据进行分析,数据以(?)±s表示,组间比较采用t-test,P0.05代表差异有统计学意义。结果通过qPCR测得COPD组中EPCs Sirt1的mRNA相对表达量较对照组明显降低(P0.01),激动剂组Sirt1 mRNA的表达量较COPD组显著增高(P0.01),抑制剂组Sirt1 mRNA表达量较COPD组显著降低(P0.05);通过qPCR测得COPD组中EPCs FOXO3a的mRNA相对表达量较对照组明显降低(P0.01),激动剂组FOXO3a mRNA的表达量较COPD组显著增高(P0.01),抑制剂组FOXO3a mRNA表达量较COPD组显著降低(P0.05);通过qPCR测得COPD组中EPCs NF-KB的mRNA相对表达量较对照组明显升高(P0.01),激动剂组NF-KB mRNA的表达量较COPD组显著降低(P0.05),抑制剂组NF-KB mRNA表达量较COPD组显著降低(P0.0001);通过qPCR测得COPD组中EPCs P53的mRNA相对表达量较对照组明显升高(P0.001),激动剂组P53 mRNA的表达量较COPD组显著降低(P0.001),抑制剂组P53 mRNA表达量较COPD组显著降低(P0.01)。通过Western blote测得COPD组中EPCs Sirt1蛋白表达量较对照组明显降低(P0.01),激动剂组Sirt1蛋白表达量较COPD组显著增高(P0.05),抑制剂组Sirt1蛋白表达量较COPD组显著降低(P0.01);通过Western blote测得COPD组中EPCs FOXO3a蛋白表达量较对照组明显降低(P0.01),激动剂组FOXO3a蛋白表达量较COPD组显著增高(P0.01),抑制剂组FOXO3a蛋白表达量较COPD组显著降低(P0.01);通过Western blote测得COPD组中EPCs NF-KB蛋白表达量较对照组明显升高(P0.05),激动剂组NF-KB蛋白表达量较COPD组显著降低(P0.05),抑制剂组NF-KB蛋白表达量较COPD组增高,但没有统计学意义(P0.05);通过Western blote测得COPD组中EPCs P53蛋白表达量较对照组明显升高(P0.01),激动剂组P53蛋白表达量较COPD组显著降低(P0.05),抑制剂组P53蛋白表达量较COPD组显著增高(P0.01)。通过细胞免疫荧光方法观察到COPD组Sirt1在EPCs表达较对照组降低,激动剂组Sirt1在EPCs中的表达较COPD组显著,抑制剂组Sirt1在EPCs中的表达较COPD组降低;通过细胞免疫荧光方法观察到COPD组FOXO3a在EPCs表达较对照组降低,激动剂组FOXO3a在EPCs中的表达较COPD组增加,抑制剂组FOXO3a在EPCs中的表达较COPD组降低;通过细胞免疫荧光方法观察到COPD组NF-KB在EPCs表达较对照组增加,激动剂组NF-KB在EPCs中的表达较COPD组降低,抑制剂组NF-KB在EPCs中的表达较COPD组增加;通过细胞免疫荧光方法观察到COPD组P53在EPCs表达较对照组增加,激动剂组P53在EPCs中的表达较COPD组降低,抑制剂组P53在EPCs中的表达较COPD组增加。同时我们测定COPD组肺组织Sirt1 mRNA的相对表达量较对照组显著低降低(P0.05),COPD组FOXO3a肺组织中mRNA的相对表达量也显著低于对照组(P0.05),NF-KB在肺组织中Sirt1 mRNA的表达显著高于对照组(P0.001);而P53的mRNA在肺组织中的表达量也显著高于对照组。COPD组大鼠肺组织中SIRT1蛋白质的表达量显著低于对照组(P0.05);FOXO3a在肺组织中的表达量也显著低于对照组(P0.05);而NF-KB蛋白表达量COPD组显著高于对照组(P0.0001);P53在COPD组大鼠肺组织的表达量是显著降低的(P0.05)。通过免疫荧光方法测定COPD组肺组织内SIRT1的表达量较对照组显著降低(P0.001);COPD组肺组织内FOXO3a表达量较对照组显著降低(P0.001),COPD组NF-KB表达量较对照组显著升高(P0.001),COPD组P53的表达量较对照组的表达量也是显著升高的(P0.05)。结论Sirt1对EPCs功能的影响主要是通过Sirt1/FOXO3a/NF-KB/P53信号通路,但是在COPD大鼠体内P53蛋白可能还受其它蛋白调控。
【图文】：

细胞的可用于以用于后续实验研究。但是）图 1-5。图1-5 EPCs细胞生长曲线FITC-UEA-I和 96h 测定可用于以用于后续实验研究。但是 COPD 组生长

浸洗爬片 3 次，1 次/3min；（7）复染核：滴加 DAPI 避光室温孵育 5min 后用 PBST 5min×4 次洗去多余的 DAPI；（8）用吸水纸吸干 PBST，用指甲油封片，然后在共聚焦显微镜下观察采集图像。2.1.1.4 统计学方法统计学处理用 SPSS20 统计软件包对数据进行分析，数据以 x±s 表示，组间比较采用 t-test，，P< 0.05 代表差异有统计学意义。2.1.2 结果2.1.2.1 EPCs 中 Sirt1 mRNA 的表达通过对 qPCR 方法测定 COPD 组 EPCs 中 Sirt1 mRNA 的相对表达量，结果对照组和实验组均有表达，且实验组表达较对照组显著低降低（P＜0.01），可见图 1，2；图 2-1
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.9

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