DNA加合物及其相关修复酶基因多态性在COPD发病中的研究

发布时间：2020-05-31 01:23

【摘要】： 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是严重危害人民身体健康的常见疾病，其发病率和死亡率在发达国家和发展中国家都呈上升趋势，对于COPD目前还没有确实有效的治疗方法，主要原因还是其发病机制不清楚。吸烟是COPD和肺癌最重要的危险因素，近90％的COPD和肺癌患者为吸烟者。在吸烟致肺癌的研究上，目前的研究发现香烟有毒成分可与细胞的DNA结合形成DNA加合物，DNA加合物可导致基因的突变、缺失和错配等，最终导致肺癌的发生，但DNA加合物是否与吸烟导致COPD发病有关以及哪种DNA加合物与吸烟导致COPD发病有关至今还未有研究。 近年来，越来越多的研究表明氧化应激在COPD发病中起重要作用。香烟烟雾含有大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，其可直接攻击生物大分子DNA，诱发DNA链断裂和多种形式的碱基修饰，进而导致DNA损伤(DNA damage)。在众多DNA氧化损伤中，以鸟嘌呤8位碳原子的氧化最常见，其氧化产物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanine，8-OHdG)为DNA经受氧化损伤的代表性产物，如其不能被有效修复，会导致DNA复制过程中G：C→T：A颠换，该颠换在肿瘤形成中发生最早，有研究发现肺癌组织8-OHdG含量高于非肺癌组织，但8-OHdG是否与吸烟导致COPD的发生有关至今还未有研究。 机体存在多种DNA修复途径以维护基因组的稳定，8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(human 8-oxoguanine DNA glycosylase，简称hOGG1)，是碱基切除修复途径中的一个重要成分，该基因产物具有DNA糖苷酶活性，可以特异性切除8-OHdG，从而避免在DNA复制过程中因错配而导致的G：C→T：A颠换突变，在维持基因组稳定上具有举足轻重的作用。有关hOGG1表达与8-OHdG的关系的研究结果不尽一致，而且有研究发现，hOGG1基因具有遗传多态性，其中位于第7外显子第1245位碱基的C／G多态，使其编码326位丝氨酸(Ser)变为半胱氨酸(Cys)，hOGG1-326Cys蛋白修复8-OHdG的活性显著低于hOGG1-326Ser蛋白，提示携带326Cys等位基因的个体有可能修复能力低下或缺陷。X射线修复交叉互补基因(X-ray repair cross complementinggroup 1，XRCC1)是另一个重要的DNA损伤修复基因，在短片修复通路中其与hOGG1直接发生相互作用。迄今为止，人类已经在XRCC1中识别了60多种单核苷酸多态，其中研究主要集中在进化保守的三个编码区，即26304C→T、27466G→A和28152G→A，这三个SNP导致相应氨基酸改变分别为194位密码子Arg→Trp、280位密码子Arg→His和399位密码子Arg→Gln，他们的生物学功能目前并不完全清楚。吸烟虽为COPD最重要的危险因素，但并非所有吸烟者均患COPD，这说明基因易感性在COPD发病中起重要作用。DNA修复基因hOGG1及XRCC1的单核苷酸多态性是否与部分吸烟者易患COPD有关至今还未见报道。 本研究包括两部分，第一部分探讨8-OHdG是否与吸烟导致COPD发生有关，本部分包括两个分题，分题一探讨淋巴细胞8-OHdG含量和肺组织8-OHdG含量的相关性，分题二探讨8-OHdG与吸烟所致COPD发病的关系；第二部分探讨hOGG1和XRCC1基因多态性与吸烟者易患COPD的关系。 第一部分8-OHdG与吸烟导致COPD发生的研究 分题1淋巴细胞8-OHdG含量与肺组织8-OHdG含量的相关性研究 【目的】探讨淋巴细胞8-OHdG含量和肺组织8-OHdG含量之间是否存在相关性。 【方法】采用淋巴细胞和肺手术切除肺组织，分为COPD组和非COPD组，通过高效液相色谱-电化学法检测8例COPD患者和8例非COPD患者淋巴细胞和肺组织8-OHdG含量。 【结果】 (1) COPD组淋巴细胞8-OHdG的含量为7．25±2．29／10~5dG，非COPD组淋巴细胞8-OHdG的含量为3.34±1．94／10~5dG，差异有显著统计学意义(P＜0．05)。 (2) COPD组肺组织的8-OHdG含量为8．15±2．19／10~5dG，非COPD组肺组织8-OHdG含量为3．19±1．51／10~5dG，差异有显著统计学意义(P＜0．05)。 (3) COPD组淋巴细胞8-OHdG含量与肺组织的8-OHdG含量呈明显正相关(r=0．768，P＜0．05)；非COPD组淋巴细胞8-OHdG含量与肺组织的8-OHdG含量呈明显正相关(r=0．787，P＜0．05)。 【结论】COPD患者淋巴细胞和肺组织8-OHdG含量明显高于非COPD患者淋巴细胞和肿组织8-OHdG含量，且淋巴细胞8-OHdG含量与肺组织8-OHdG含量存在明显相关性，提示可以用淋巴细胞8-OHdG研究吸烟导致COPD发病的关系。 分题2 8-OHdG与吸烟所致COPD发病的关系 【目的】探讨8-OHdG在吸烟所致COPD发病中的作用，以及活性氧水平、hOGG1mRNA及hOGG1蛋白表达水平对8-OHdG含量的影响。 【方法】收集140例健康不吸烟者、143例健康吸烟者和129例吸烟COPD者静脉血，分离淋巴细胞，采用高效液相色谱-电化学法检测8-OHdG含量，2'，7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内ROS水平，实时定量PCR(Real-time PCR)检测hOGG1 mRNA表达，Western Blot检测hOGG1蛋白表达。 【结果】 (1)健康吸烟组和吸烟COPD组淋巴细胞8-OHdG含量明显高于健康不吸烟组，差异有显著统计学意义(P＜0．05)，且吸烟COPD组淋巴细胞8-OHdG含量明显高于健康吸烟组，差异亦有显著统计学意义(P＜0．05)。 (2)健康吸烟组和吸烟COPD组淋巴细胞ROS、hOGG1 mRNA及hOGG1蛋白表达均明显高于健康不吸烟组，差异有显著统计学意义(P＜0．05)；吸烟COPD组淋巴细胞ROS水平明显高于健康吸烟组，差异有显著统计学意义(P＜0．05)；吸烟COPD组淋巴细胞hOGG1 mRNA及hOGG1蛋白表达水平明显低于健康吸烟组，差异有显著统计学意义(P＜0．05)。 (3)健康吸烟组及吸烟COPD组淋巴细胞8-OHdG含量与吸烟指数均呈明显正相关(P＜0．05)；三组淋巴细胞8-OHdG含量与淋巴细胞ROS水平均呈明显正相关(P＜0．05)，与hOGG1 mRNA表达水平呈明显负相关(P＜0．05)，与hOGG1蛋白表达水平亦呈明显负相关(P＜0．05)。 (4)健康不吸烟组和健康吸烟组淋巴细胞8-OHdG含量与FEV_1％预计值和FEV_1／FVC均无明显相关性(P＞0．05)；而吸烟COPD组淋巴细胞8-OHdG含量与FEV_1％预计值和FEV_1／FVC呈显著负相关性(r=-0．575、-0．448，P＜0．05)。 【结论】吸烟COPD组淋巴细胞8-OHdG含量明显高于健康不吸烟组与健康吸烟组淋巴细胞8-OHdG含量，提示8-OHdG水平升高与吸烟导致COPD发病有关。 第二部分hOGG1和XRCC1基因多态性与吸烟者易患COPD的关系 【目的】探讨DNA修复基因hOGG1 Ser326Cys和XRCC1 Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln基因多态性与COPD易感性的关系。 【方法】收集201例COPD患者和309例对照，用聚合酶链反应和限制性片段长度多态方法(PCR-RFLP)分析hOGG1第326密码子和XRCC1第194、280及399密码子基因多态性。 【结果】 (1) hOGG1 Ser326Cys基因型携带者和Cys326Cys基因型携带者与Ser326Ser基因型携带者相比，COPD患病风险无明显差异；XRCC1 Gln399Gln基因型携带者与Arg399Arg基因型携带者相比COPD患病风险亦无明显差异；但XRCC1Arg399Gln基因型携带者患COPD风险明显高于Arg399Arg基因型携带者，其校正后相对危险度为1．55(95％CI 1．05-2．29，P＜0．05)。按吸烟特征分层后，携带有hOGG1 Cys326Cys基因型的现在吸烟者患COPD的风险明显高于携带Ser326Ser基因型的现在吸烟者，校正后相对危险度为5．07(95％CI 1．84-13．95，P＜0．05)；携带有XRCC1 Arg399Gln基因型的现在吸烟者患COPD的风险明显高于携带Arg399Arg基因型的现在吸烟者，校正后相对危险度为2．77(95％CI1．52-5．07，P＜0．05)。按照吸烟强度分层后，携带有hOGG1 Cys326Cys基因型的轻吸烟者患COPD的风险明显高于携带Ser／Ser基因型的轻度吸烟者，校正后相对危险度为4．02(95％CI 1．05-16．80，P＜0．05)；携带有XRCC1 Gln399Gln基因型的轻度吸烟者患COPD的风险明显高于携带Arg399Arg基因型的轻度吸烟者，校正后相对危险度为4．48(95％CI 1．35-14．90，P＜0．05)；携带有XRCC1Arg399Gln基因型的重度吸烟者患COPD的风险明显高于携带Arg399Arg基因型的重度吸烟者，校正后相对危险度为2．55(95％CI 1．42-4．58．P＜0．05)。 (2) XRCC1 Trp194Trp基因型携带者与Arg194Arg基因型携带者相比患COPD的风险无明显差异，但经吸烟特征和吸烟强度分层后，在戒烟者层，携带XRCC1Trp194Trp基因型者相较于Arg194Arg基因型者患COPD风险减低，其校正后相对危险度为0．22(95％CI 0．06-0．85，P＜0．05);在轻度吸烟者层，携带XRCC1Arg194Trp基因型和Trp194Trp基因型者相较于Arg194Arg基因型者患COPD风险都减低，其校正后相对危险度分别为0．39(95％CI 0．16-0．94，，P＜0．05)和0．24(95％CI 0．07-0．79．P＜0．05)。 (3) XRCC1 Arg280His三种基因型在COPD组的频率与在对照组的频率无明显差异(P＞0．05)，按吸烟特征和吸烟强度分层后，在不吸烟者层、戒烟者层、现在吸烟者层、轻度吸烟者层和重度吸烟者层XRCC1 Arg280His三种基因型在COPD组的频率与在对照组的频率均无明显差异(P＞0．05)。 【结论】hOGG1 326Cys和XRCC1 399Gln明显升高现在吸烟者和轻度吸烟者患COPD的危险度，XRCC1 194Trp与降低戒烟者和轻度吸烟者患COPD的风险有关，XRCC1 280His与COPD患病风险无明显相关性。
【图文】：

一OHdG标准品
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R563.9

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本文编号：2689037