MSCs分泌的微泡通过转移线粒体促进PMVECs修复的研究

发布时间：2020-06-04 00:38

【摘要】：研究目的:研究间充质干细胞(MSCs)分泌的微泡(MVs)通过转移线粒体对受损肺微血管内皮细胞(PMVECs)的修复作用。研究方法:(1)为筛选出浓聚线粒体的最佳培养条件,将MSCs置于常氧(21%O_2)及低氧(1%O_2)条件下分别培养24、48、72h后提取上清,使用差速离心法将上清中的微泡分离提取出来,电镜下观察MVs的形态及大小,流式分析MV表面标志物,二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法测定MVs的蛋白浓度,JC-1判断细胞凋亡,Western blot检测线粒体相关蛋白(CYP1A1、CYP1A2)的表达。(2)为观察MVs中线粒体向PMVECs中转移,分别用荧光染料染MSC-MVs和PMVECs的线粒体,在共聚焦荧光显微镜下观察线粒体的转移情况;将MSCs、MVs与脂多糖(LPS)诱导损伤的PMVECs共培养,分为EC组、EC+LPS组、EC+LPS+MSC组、EC+LPS+MV组,Western blot检测共培养后内皮细胞中线粒体相关蛋白的变化。(3)为评估线粒体对受损内皮细胞的修复作用,我们使用罗丹明-6G(rho)抑制线粒体呼吸链,用JC-1及ROS试剂盒评估线粒体功能是否被抑制。然后将MSCs、MVs、MVs-rho与脂多糖(LPS)诱导损伤的PMVECs共培养,分为EC组、EC+LPS组、EC+LPS+MSC组、EC+LPS+MV组和EC+LPS+MV-rho组,Western blot检测内皮细胞合成(iNOS、eNOS)及连接蛋白(VE-cadherin)的表达,FITC-葡聚糖法检测内皮细胞的通透性,流式检测内皮细胞的早期和晚期凋亡率,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,ELISA检测炎症因子(IL-6、IL-10)水平,ROS试剂盒评估活性氧簇的变化。研究结果:(1)电镜观察常氧及低氧均能分离出直径为100~1000nm之间的圆形/卵圆形膜性结构的MVs;流式检测MVs表面标志物CD44和CD29均呈阳性表达,表达率分别为97.6%和95.9%,CD34为阴性表达;24h常氧培养为分离MVs、线粒体浓度的最佳培养条件。(2)共聚焦显微镜下直视看到MSC-MVs中的线粒体能够向PMVECs转移;Western blot结果显示MSC及MV组均能显著增加PMVECs中CYP1A1和CYP1A2的蛋白表达。(3)使用罗丹明-6G后,线粒体膜电位及ROS显著降低;与LPS损伤组相比,MSC、MV共培养组可以显著改善内皮细胞合成(iNOS、eNOS),增加抗炎细胞因子(IL-10)的水平,降低内皮细胞通透性,降低早期凋亡率以及活性氧水平,内皮细胞间连接蛋白(VE-cadherin)的表达较LPS组相比有升高趋势,但差异没有统计学意义;MV-rho组与MSC组、MV组相比,内皮细胞合成蛋白以及抗炎因子的表达显著降低,内皮细胞通透性、早期凋亡率、活性氧的水平显著升高,内皮细胞间连接蛋白的表达较MSC、MV组相比有降低趋势,但差异没有统计学意义。研究结论:MSCs可以通过MVs向PMVECs转移线粒体,并减轻PMVECs的损伤。
【图文】：

电镜下观察MVs的形态及大小

流式检测MVs表面标记物
【学位授予单位】：电子科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563.8

【参考文献】

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本文编号：2695631