重组腺相关病毒载体抑制支气管哮喘淋巴细胞表达白细胞介素4

发布时间：2020-06-05 18:46

【摘要】： 第一部分筛选反义寡核苷酸抑制哮喘大鼠CD4~+T细胞IL-4表达的研究 目的：探讨针对大鼠白细胞介素4的反义寡核苷酸能否有效干预哮喘大鼠CD4~+T淋巴细胞表达IL-4，并分析不同序列的反义寡核苷酸对哮喘大鼠CD4~+T细胞IL-4表达的抑制作用是否存在差异。 方法：建立哮喘大鼠模型，密度梯度离心法分离大鼠外周血单个核细胞，在此基础上使用免疫磁珠分离哮喘大鼠CD4~+T淋巴细胞，采用阳离子脂质体转染技术，将不同的反义寡核苷酸(AS-1：反外显子-1；AS-2：反外显子-2；AS-3：反翻译终止部位)和空白对照分别转入哮喘大鼠CD4~+T淋巴细胞，细胞培养24小时后，用ELISA和半定量RT-PCR分别检测细胞培养上清IL-4和细胞内IL-4mRNA的水平。 结果：不同组RT-PCR结果(IL-4／β-actin相对吸光度)：AS-1、AS-2、AS-3及空白组分别为0.2615±0.1476，0.2885±0.1411，1.1012±0.3641及1.2068±0.3836(F=22.597，P＜0.01)。ELISA检测培养上清液IL-4结果：AS-1、AS-2、AS-3及空白组分别为13.800±7.233，15.329±7.358，52.643±12.075及58.286±14.100(F=34.976，P＜0.01)。经AS-1、2干预后细胞内IL-4mRNA和细胞培养上清IL-4的水平均较AS-3和空白组干预后IL-4的水平低(P＜0.01)。 结论：IL-4反义寡核苷酸能够抑制哮喘大鼠CD4~+T淋巴细胞IL-4和IL-4mRNA表达；不同序列IL-4反义寡核苷酸抑制作用存在差异。 第二部分携带白介素-4反义基因的腺相关病毒质粒载体的构建及鉴定 目的：IL-4在哮喘的发生发展中起着重要的触发和推动作用。因而，构建携带大鼠反义IL-4基因并含有腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列(ITR)结构的质粒pasIL4，为今后利用其进行哮喘基因治疗的研究奠定基础。 方法：利用基因重组技术将大鼠IL-4 cDNA反向克隆到已酶切去除绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体phMGFP中，构建重组中间质粒载体。通过PCR技术扩增获取重组中间质粒载体上的目的片段CMV_p-asIL4-SV40_E，将此目的片段定向插入已酶切处理的psub201中，构建出重组质粒pasIL4。进一步通过阳离子脂质体介导，将pasIL4转染哮喘大鼠CD4~+T细胞，RT-PCR法和ELISA法分别检测细胞中IL-4 mRNA和细胞培养上清液IL-4蛋白的变化。 结果：pasIL4经限制性酶切及部分序列测序分析证实IL-4反向插入正确。pasIL4重组质粒转染的CD4~+T细胞IL-4 mRNA水平和细胞培养上清液中IL-4水平较未转染组明显下降。 结论：pasIL4重组质粒载体构建成功，为今后利用其进行哮喘基因治疗的研究奠定基础。 第三部分反义白介素4重组腺相关病毒载体对哮喘大鼠体外培养CD4~+T淋巴细胞的影响 目的：构建含有反义IL-4基因的重组腺相关病毒载体(rAAV-asIL4)，评估我们所采用的rAAV包装和纯化技术能否获取高滴度、高纯度rAAV用于今后的实验，并初步观测其对取自哮喘大鼠模型的体外培养CD4~+T淋巴细胞作用， 方法：磷酸钙沉淀法将质粒pasIL4、pXX2及pXX680共转染293T细胞合成携带反义IL-4基因的重组腺相关病毒(rAAV-asIL4)，采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法”纯化rAAV。Southern blot法检测合成病毒的滴度；rAAV-GFP感染293T细胞，通过倒置荧光显微镜计数荧光细胞数评估病毒活性。rAAV-asIL4感染体外培养的CD4~+T淋巴细胞，RT-PCR法检测细胞内IL-4 mRNA变化，ELISA法检测培养液上清中IL-4蛋白变化。 结果：Southern blot检测rAAV-asIL4和rAAV-GFP的滴度均为2.5×10~(12)病毒颗粒／ml。10μl rAAV-GFP病毒液分别感染293T细胞后，倒置荧光显微镜下计算荧光细胞百分比为82.1％。体外实验中rAAV-asIL4处理组(T_0)IL-4 mRNA和蛋白水平均较A_0和C_0组明显降低。 结论：我们可以合成并获取高滴度、有活性的rAAV。rAAV-asIL4能抑制体外培养的淋巴细胞合成分泌IL-4，为今后的研究奠定了基础。 第四部分反义白介素4重组腺相关病毒载体尾静脉给药对哮喘大鼠的影响 目的：构建含有反义IL-4基因的重组腺相关病毒载体(rAAV-asIL4)，观测其对哮喘大鼠模型作用，探讨rAAV-asIL4对于哮喘治疗的潜在作用。 方法：pasIL4、pXX2及pXX6三质粒共转染法构建rAAV-asIL4，并以southern blot检测病毒滴度。体内实验，将24只SD大鼠随机分为4组，即正常大鼠组(group N)，哮喘未干预组(group A)，哮喘rAAV-asIL4处理组(group T)及哮喘rAAV-GFP处理组(group C)。哮喘A、T及C组大鼠常规制作哮喘模型；T和C组大鼠于致敏前1天(day 0)和激发当天(day 14)2次通过尾静脉给予0.5ml(浓度1.25×10~(12)病毒颗粒／ml)相应病毒液rAAV-asIL4和rAAV-GFP；N和A大鼠尾静脉给予PBS代替。大鼠于末次激发后(day 21)收集外周血标本，左肺支气管肺泡灌洗液标本(BALF)，右上肺、右下肺、肝组织及右肾组织标本。RT-PCR检测外周血单个核细胞和右上肺组织中IL-4 mRNA；ELISA检测外周血血清中IL-4、IgE以及BALF中IL-4蛋白含量；右下肺、肝组织及右肾标本作石蜡切片，HE染色观测病理学改变。 结果：T组外周血血清中IL-4、IgE以及BALF中IL-4蛋白含量较A和C组明显降低；肺组织切片组织学观测T组病变较A和C组轻；肝肾组织切片T组未观测到明显病变。 结论：rAAV-asIL4对哮喘有治疗作用，同时短期内副作用小，可能具有临床应用前景。 第五部分反义白介素4重组腺相关病毒载体气道给药对哮喘大鼠的影响 目的：构建携带反义IL-4基因的重组腺相关病毒(rAAV)真核表达载体，并以此干预大鼠哮喘模型，探讨其作为哮喘基因治疗方案的可行性。 方法：磷酸钙沉淀法将质粒pasIL4、pXX2及pXX680共转染293T细胞合成携带反义IL-4基因的重组腺相关病毒(rAAV-asIL4)。Southern blot法检测合成病毒的滴度。rAAV-asIL4在动物实验开始的第1天和第14天2次通过气道给药干预哮喘大鼠(T组)，，实验中同时设立大鼠正常组(N组)、哮喘组(A组)以及rAAV-GFP干预组(C组)。末次激发后处理大鼠，计数肺泡灌洗液(BALF)中有核细胞以及嗜酸性粒细胞总数，ELISA检测BALF中IL-4和IgE蛋白量，RT-PCR检测肺组织IL-4 mRNA变化，取肺组织作病理学检查。 结果：分析BALF中有核细胞细胞总数和嗜酸性粒细胞总数结果表明：T组该2项指标较A组和C组有降低趋势，但这3组间并无明显统计学差异(P＞0.05)。BALF中IL-4、IgE的ELISA检测结果以及肺组织IL-4 mRNA RT-PCR半定量检测结果表明：T组的上述指标水平较A组和C组均明显降低(P＜0.01)。T组大鼠肺组织病理学改变较A组和C组轻。 结论：携带反义IL-4基因的rAAV载体，通过气道给药的方式干预哮喘大鼠模型，具有一定的疗效。rAAV-asIL4可能具有一定临床应用前景，同时局部给药的方式可能具有一定价值。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R562.25

【参考文献】

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1 吴小兵,董小岩,伍志坚,屈建国,侯云德;一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法[J];科学通报;2000年19期

2 高亚东,熊盛道,徐永健,张珍祥,刘先胜;一氧化氮对哮喘大鼠支气管平滑肌细胞钾通道的作用[J];中华结核和呼吸杂志;2003年10期

本文编号：2698457