固有免疫系统在铜绿假单胞菌肺部感染中的作用

发布时间：2020-06-08 12:57

【摘要】： 背景与目的： 铜绿假单胞菌肺部感染是医院感染死亡的主要原因之一。作为机会致病菌，铜绿假单胞菌可以根据环境改变自身基因表达，具有极强的适应能力和适时多变的毒力，通过与宿主免疫系统相互作用、相互调节共同决定着感染的结局。肺固有免疫系统在铜绿假单胞菌感染中起着重要作用，对其机制的深入研究对临床工作有指导意义。为此，本文拟从分子水平、细胞水平、器官水平研究不同状态下同一株铜绿假单胞菌引起感染时宿主固有免疫系统(TLRs和NOD2)的变化和功能，为临床诊断和治疗提供理论依据。 方法： 1、本研究采用铜绿假单胞菌ATCC 27853通过LB液体培养基培养法和体外改良平板培养法分别建立浮游菌和生物被膜菌。分别用这两种状态下的菌株作用于人呼吸道上皮细胞株A549、HBE，构建体外感染模型。采用RT-PCR和Western blot方法检测TLR2、TLR4、TLR5和NOD2的表达、ELISA法检测细胞上清中IL-6、IL-8水平，，应用Western blot方法测定浮游菌感染模型中TRAF6、NF-κB蛋白表达量。 2、采用分别处于上述两种状态的菌株建立大鼠铜绿假单胞菌肺部感染模型，按随机原则将66只SD大鼠分为对照组、浮游菌感染组、生物被膜菌感染组。分别于浮游菌感染组建模后4h、1d、3d，生物被膜菌感染组建模后4h、7d、14d采集标本，进行肺组织病理形态学观察，采用RT-PCR、Western blot法检测肺组织TLR2、TLR4、TLR5和NOD2的表达。 3、浮游菌作用A549细胞4h后，提取细胞上清中的分泌蛋白进行双向凝胶电泳，寻找表达差异显著的蛋白点进行质谱鉴定。 结果： 1、体外感染模型中，TLR2的表达无明显差异(P＞0.05)；TLR4在浮游菌和被膜菌感染4h组表达上调(P＜0.05)，TLR5mRNA水平在浮游菌作用的15min即发生明显上调，至作用30min组升至最高点，随后有下降趋势(P＜0.05)；TRAF6和NF-κB与TLR5的表达情况基本一致。IL-6、IL-8水平随着作用时间的延长逐渐上调(P＜0.05)。 2、动物感染模型中，浮游菌感染组和被膜菌感染组的病理变化差异明显。浮游菌感染组中，TLR2的表达无明显差异(P＞0.05)；TLR4的表达在3d组中上调(P＜0.05)；TLR5水平在4h组显著增高以后逐渐下调(P＜0.05)；NOD2的表达在4h组上调后恢复正常(P＜0.05)。生物被膜菌感染组中，TLR2、TLR5、NOD2的表达逐渐增高(P＜0.05)，TLR4的表达在d14组明显增高(P＜0.05)。 3、获得了分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱，取对照组和浮游菌处理组中表达差异显著的蛋白质点进行肽质指纹分析，经数据库查询，表达差异显著的蛋白可能为Notchless protein homolog 1，其功能尚未阐明。 结论： 1、处于不同状态下的同一菌株引起感染的病程和结局不同，铜绿假单胞菌根据外环境调节自身状态在机会感染中有重要意义 2、不是TLR2／TLR4而是鞭毛蛋白结合TLR5介导的MyD88／TRAF6／NF-κB信号通路在铜绿假单胞菌感染初始阶段起主要作用 3、在铜绿假单胞菌慢性感染中肺固有免疫系统被充分激活
【图文】：

2.间接免疫荧光法在A549和HBE细胞中均检测到TLRZ、TLR4、TLRS、NODZ蛋白在细胞内表达图2一1图2一3图2一4图2一5图2间接免疫荧光法在A抖9中检测丁LRS、NODZ蛋白l狗表达情况2小阴性对照(PBS代替一抗);2一2:NODZ;2一3:TLRZ;2一4:TLR4;2一5:TLRS

与L尸S作用4h组比较.:l〕 <0.05，图3一 6LPS作用组HBE细胞TLR4mRNA的表达水平 TLR489KDAetl一 143KD、对照组;2、LPS作用211组3、LPS作用4h组图3一7W亡stern方法检测TLR4蛋白表达水平一____五___住 123自曰门曰日自枕崛一王恤肖从对照组:2、LPS作用211组:3、LPS△:P<0.05，与对照组比较;▲与LPS作用4h组比较作用41飞组P<0.05，与LPS作用Zh组比较;，:P<0.05，图3一 8LPS作用组HBE细胞TLR4蛋白表达水平 3.3LPS刺激HBE细胞引起NODZ表达上调100ng/mlLPS蛋白刺激HBE，细胞内NODZ的表达随时间增加上调(尸<0.05，=3)。(见图3一9、10) M123 22()bPGAPDH ]57bPNODZ M:Markerl()ObPladder:图3一9l、对照组:2、LPS作用Zh组3、LPS作用4h组RT-PCR方法检测NODZmRNA的表达水平
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R563.1

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本文编号：2703123