哮喘小鼠气道平滑肌原代细胞增殖周期及细胞周期蛋白D1表达的研究

发布时间：2020-06-18 20:46

【摘要】： 第一部分哮喘小鼠模型的制备 目的制备哮喘小鼠模型。 方法将3周龄雄性SPF级Balb／c小鼠16只，随机分成哮喘组和对照组，每组8只。哮喘组于第0、7、14天每只腹腔内注射抗原混悬液0.1ml(含鸡卵清蛋白10mg和氢氧化铝干粉10mg溶于生理盐水中)致敏；第15天开始雾化吸入1％OVA激发哮喘，每周2至3次，每次30min，连续6周。对照组以等量生理盐水进行致敏和激发，每周2至3次，每次30min，连续6周。两组小鼠均于末次雾化吸入后24小时颈椎脱臼处死，无菌取气管作细胞培养实验，取左肺中叶作肺组织HE染色。 结果 1．哮喘组小鼠在雾化致喘后出现较明显的头、面部搔痒，进而呼吸加深、加快、点头样喘息明显、安静少动、弓背、前肢缩抬，掌面出现明显皮疹。对照组小鼠无喘息等表现。 2．肺组织切片HE染色可见正常组小鼠气道上皮完整，无炎细胞浸润及平滑肌层增厚等改变；哮喘组小鼠有气道上皮细胞破坏，支气管周围有大量嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润及平滑肌细胞层增厚等改变结果。 结论本实验成功制备了小鼠哮喘模型，为进一步研究奠定了基础。 第二部分原代培养小鼠气道平滑肌细胞 目的建立原代培养小鼠的气道平滑肌细胞的可行方法，为相关疾病的研究提供实验材料。 方法选取正常组和哮喘组同周龄的Balb／c小鼠，运用组织贴块法培养小鼠的气道平滑肌细胞，并综合了自然纯化、机械刮除法、时差贴壁法等多种方法纯化气道平滑肌细胞。 结果接种的组织块活力良好，第三代气道平滑肌细胞纯度可以达到95％以上。运用间接免疫荧光法对平滑肌细胞α-肌动蛋白(α-actin)进行免疫细胞化学染色，90％以上细胞染色结果为阳性，冻存后复苏细胞活力良好。 结论对于取材较少、操作相对困难的小鼠气道平滑肌细胞，以组织贴块法原代培养较为可靠，方法简便，获得ASMC纯度较高，为进行相关细胞生物学研究提供了材料。 第三部分哮喘小鼠气道平滑肌细胞增殖及cyclin D1表达的差异 目的研究哮喘小鼠气道重建模型中气道平滑肌细胞(ASMC)的细胞增殖、细胞周期及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的变化，探讨cyclin D1对支气管哮喘气道重建中平滑肌细胞增殖过程及细胞周期的影响，进而为哮喘的临床诊断和治疗提供新的依据。 方法以原代培养的正常小鼠ASMC为对照组研究哮喘组ASMC，用四唑盐比色试验(MTT)检测细胞增殖能力，流式细胞术(FCM)测定细胞周期，免疫细胞化学证实cyclinD1在ASMC中的表达，FCM检测cyclinD1表达量。 结果 1．MTT法分析哮喘小鼠ASMC的增殖差异：哮喘组小鼠的ASMC与正常组小鼠同代ASMC比较，前者细胞增殖显著增快，MTT法测得各时间点的哮喘组细胞的平均A值均高于正常组细胞，差异有显著性(P＜0.05)。 2．FCM分析哮喘小鼠ASMC周期变化：哮喘组细胞周期与正常组有显著差别，哮喘组增殖期(S期)百分比较正常组明显增高。 3．免疫荧光细胞化学观察Cyclin D1在ASMC表达情况：用激光共聚焦显微镜观察结果，正常、哮喘两组ASMC均有Cyclin D1的表达，主要分布于胞质内。 4．FCM分析Cyclin D1在哮喘小鼠ASMC中的差异表达。3次分析取材于ASMC生长周期中的不同时间点，各次的2组间比较结果的趋势一致：哮喘组细胞表达的Cyclin D1显著高于A组的表达，差异有显著性(P＜0.05)。 结论在哮喘气道重建过程中ASMC经历了一定程度的过增殖过程，cyclin D1的表达增加参与了细胞增殖。气道重建环境可刺激气道平滑肌细胞增殖能力。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R562.25
【图文】：

炎细胞浸润及平滑j]L层增厚等改变;哮喘组刁、鼠气道上皮细胞水肿、破坏，肺泡隔增厚，支气管及血管周围有大量嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润及平滑肌细胞层增厚等改变。(图1)

图2.ASMC原代培养后的相差显微镜观察(/10的左图为3天，右图为7天。F192.Phase一eontrastmieroseoPyofsmoothmuseleeelluPon3and7dayseultUre图3培养第4代的ASMC193ThefourthPassageeulturedmouseASMCs(X100)

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1 卓致远;哮喘小鼠气道平滑肌原代细胞增殖周期及细胞周期蛋白D1表达的研究[D];南京医科大学;2007年

本文编号：2719810