SIRT1在气管损伤性气管狭窄中作用的初步研究

发布时间：2020-06-18 21:11

【摘要】：气管插管、气管切开、手术等致气道损伤的医源性因素以及气管支气管结核、良性肿瘤、外伤等均是良性气管狭窄的常见原因,可引起气道炎症和肉芽组织、疤痕组织增生,造成严重的气道狭窄,甚至危及生命。虽然有气管球囊扩张、热消融切除、支架置入等呼吸介入治疗手段,很多患者在介入治疗后,仍会出现肉芽疤痕组织增生,形成再狭窄,复发率高达40-70%,是临床大夫面临的挑战性难题。因此,探讨气管损伤性气管狭窄的致病机制及其防治措施,具有重要的临床意义。本课题组前期的研究表明,兔气管损伤性气管狭窄模型中存在炎症及纤维化损伤,十四元环大环内酯类抗生素红霉素(EM)等药物可减轻气管损伤性气管狭窄,具体机制尚不明确。近年研究表明,III型组蛋白去乙酰化酶SIRT1在抑制炎症和脏器纤维化中起到重要作用,可能成为某些炎症和纤维化疾病的治疗靶点。然而,鲜有关于SIRT1在气管损伤性气管狭窄中的报道,SIRT1是否在气管损伤性气管狭窄的发病中起到一定作用?EM是否通过影响SIRT1表达,发挥对气管损伤性气管狭窄的抑制作用?仍有待研究。本研究旨在初步探讨气管损伤性气管狭窄的发病机制及调控,在组织细胞水平观察SIRT1在气管狭窄组织以及气管成纤维细胞中的表达,进一步探讨EM及布地奈德(BUD)在气管损伤性气管狭窄中的防治作用及机理,为此,本研究开展如下:第一部分兔气管损伤性气管狭窄中炎症及纤维化变化及药物干预的研究目的:探讨兔气管损伤性气管狭窄模型中炎症及纤维化指标的变化趋势,研究EM及联合BUD药物组合对气管损伤性气管狭窄的干预作用。方法:24只新西兰大耳白兔随机分为4组(各组n=6),其中A组为模型组,B组为红霉素组,C组为布地奈德组,D组为联合用药组。每组均行气管切开,以尼龙刷损伤气管粘膜及缝合,建立气管损伤性气管狭窄模型。除A组外,其余各组分别在术前1周至术后第9日,予相应药物处理,术后第10天采集血标本,应用ELISA法检测TGF-β1、VEGF、IL-6、IL-8血清浓度。收集气管组织行HE染色,观察各组气管组织病理改变及测量气管狭窄率。行气管免疫组织化学染色观察COL-I、COL-III表达情况。结果:B组及D组血清TGF-β1、VEGF、IL-1、IL-8均显著低于A组(均P0.05)。A~D组气管内可见不同程度肉芽组织增生致气管狭窄,其中A组管腔狭窄率为(53.3±4.4)%,B组~D组气管狭窄率分别为(24.3±4.4)%,(47.8±6.5)%、(15.6±2.0)%,其中B组和D组气管狭窄率显著低于A组(均P0.05)。各组COL-I、COL-III均有表达,B组及D组COL-I、COL-III蛋白表达量显著低于A组(P0.05)。结论:兔气管损伤性气管狭窄中存在明显的炎症及纤维化损伤,EM可减轻气管损伤性气管狭窄,联合BUD效果更佳,可能与减轻气管损伤后的炎症反应及纤维化进程有关。第二部分SIRT1在兔气管损伤性气管狭窄组织中表达及药物干预的研究目的:检测兔气管损伤性气管狭窄组织中SIRT1的表达情况以及及应用EM或联合BUD对SIRT1表达干预的变化。方法:24只新西兰大耳白兔随机分为4组(各组n=6),其中A组为模型组,B组为红霉素组,C组为布地奈德组,D组为联合用药组。每组均行气管切开,以尼龙刷损伤气管粘膜及缝合建立气管损伤性气管狭窄模型。除A组外,其余各组分别在术前1周至术后第9日,予相应药物处理,术后第10天收集气管组织行SIRT1免疫组化染色,观察各组SIRT1表达情况。结果:A组气管狭窄组织中SIRT1少量表达,同A组相比,B组及D组SIRT1表达显著增加,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:EM及联合BUD能提升气管狭窄组织中SIRT1的表达,EM减轻气管损伤性气管狭窄的炎症及纤维化进程,可能部分是通过增强SIRT1表达而起作用。第三部分EM减轻气管成纤维细胞炎症及纤维化机制的初步探讨目的:探讨EM联合BUD对TGF-β1刺激下人气管成纤维细胞炎症及纤维化指标的影响及可能作用机制。方法:体外培养人气管成纤维细胞,分为正常对照(NC)组,TGF-β1组,EM 1mg/L(EM1)组,EM 10mg/L(EM10)组,BUD组,EM10+BUD组。TGF-β1组应用10ng/m L的TGF-β1刺激,EM1组及EM10组分别为TGF-β1刺激前2小时预先给予浓度为1mg/L及10mg/L的红霉素干预,BUD组为TGF-β1刺激前2小时应用浓度为10n M布地奈德干预,EM10+BUD组为用TGF-β1刺激前2小时应用10mg/L的红霉素联合10n M布地奈德联合干预,应用ELISA评估TGF-β1刺激后及用药干预后24小时,细胞培养上清炎症因子IL-6,IL-8变化情况,应用RT-PCR检测各组COL-1、IL-6表达情况,应用RT-PCR及免疫荧光检测各组SIRT1表达情况。结果:1.与NC组相比,TGF-β1组细胞培养上清IL-6、IL-8显著升高;EM1组,EM10组,BUD组及EM10+BUD组均能显著降低细胞培养上清IL-6、IL-8浓度(P0.05),其中EM1组和EM10组无明显差异,而EM10+BUD组显著优于单用EM或BUD组(P0.05)。2.与NC组相比,TGF-β1组COL-1、IL-6的m RNA显著升高,SIRT1的m RNA水平无显著变化,EM1组、EM10组、EM10+BUD组均能显著提升SIRT1表达(P0.05);EM1组、EM10组、BUD组、EM10+BUD组均能显著降低COL-1、IL-6的表达(P0.05),其中EM10+BUD组效果最佳。3.TGF-β1组SIRT1免疫荧光表达较NC组无明显变化,EM10组,EM10+BUD组SIRT1免疫荧光表达增强。结论:1.EM减少TGF-β1作用下气管成纤维细胞IL-6、IL-8以及COL-1的表达,减轻炎症及纤维化,EM联合BUD有更佳的协同效果。EM可能通过提升SIRT1发挥上述干预作用。2.EM联合糖皮质激素有望成为气管损伤性气管狭窄及再狭窄的有效辅助治疗药。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R562.12
【图文】：

管腔狭窄,肉眼观察,气管

图 1-1 各组兔血清中炎症因子浓度Figure 1-1 The serum concentratioins of inflammatory cytokines in different group*compared the same factor with Agroup, P＜0.05.# compared the same factor with B group, P＜0.02 各组兔气管组织肉眼观察及 HE 染色情况肉眼见各组兔气管管腔存在不同程度狭窄，肉芽组织增生，D 组肉组织增生及管腔狭窄明显减轻（图 1-2）。组织病理学切片 HE 染色提示A 组气管狭窄段可见上皮细胞脱落，局部鳞状上皮化生，粘膜下明显肉组织增生，可见单核淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、纤维母细胞浸润及小血增生，而其余三组肉芽组织增生情况均有所减轻，D 组仅有少许粘膜下生，炎症细胞浸润及新生血管均明显减少（图 1-3）。

炎症因子,兔血清,气管,肉眼观察

图 1-1 各组兔血清中炎症因子浓度Figure 1-1 The serum concentratioins of inflammatory cytokines in different groupcompared the same factor with Agroup, P＜0.05.# compared the same factor with B group, P＜0.各组兔气管组织肉眼观察及 HE 染色情况肉眼见各组兔气管管腔存在不同程度狭窄，肉芽组织增生，D 组肉织增生及管腔狭窄明显减轻（图 1-2）。组织病理学切片 HE 染色提组气管狭窄段可见上皮细胞脱落，局部鳞状上皮化生，粘膜下明显肉织增生，可见单核淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、纤维母细胞浸润及小血生，而其余三组肉芽组织增生情况均有所减轻，D 组仅有少许粘膜下，炎症细胞浸润及新生血管均明显减少（图 1-3）。

【参考文献】