穿心莲内酯联用阿奇霉素对大鼠细菌感染性肺炎的协同治疗作用研究

发布时间：2020-06-24 20:10

【摘要】：目的1.通过文献查阅,考察中西药联合使用对临床治疗细菌感染性疾病的优势和特色;2.考察穿心莲内酯联用阿奇霉素对肺炎克雷伯菌引起的感染性肺炎大鼠模型的体内治疗作用,为临床两药联合使用的必要性提供实验依据;3.考察穿心莲内酯单用及与阿奇霉素联合使用对巨噬细胞炎症因子IL-6释放的抑制作用,初步从细胞水平探讨穿心莲内酯与阿奇霉素的抗感染协同作用。方法1.以穿心莲内酯为研究切入点,抗生素、合理使用、不良反应、滥用、穿心莲内酯、联用为关键字,采用文献查阅研究法分析抗生素的使用现状、穿心莲内酯联用阿奇霉素在临床治疗细菌感染性肺炎方面的价值与优势;2.采用牛津管法考察穿心莲内酯和阿奇霉素单独或联合使用在体外对肺炎克雷伯菌的抑制作用;3.将已增毒的肺炎克雷伯菌混悬液以气管直接注入法构建大鼠感染性肺炎模型。造模后3天后,以灌胃方式分别给予各组动物40.5mg/kg·d穿心莲内酯(单用穿心莲内酯组)、4.5mg/kg·d阿奇霉素(单用阿奇霉素组)、40.5mg/kg·d穿心莲内酯+4.5mg/kg·d阿奇霉素(联用高剂量组)、20.25mg/kg·d穿心莲内酯+4.5mg/kg·d阿奇霉素(联用中剂量组)、10.125mg/kg·d穿心莲内酯+4.5mg/kg·d阿奇霉素(联用低剂量组)进行干预;于给药后第一天(即造模后第4天)对麻醉状态大鼠行腹主动脉采血,制备血清。每组取样3日。血清使用液相悬浮芯片技术同时检测TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A含量。并将造模后第3天及给药第3天的各组动物肺组织进行病理检测。分析比较药物单用及联用对细菌感染性肺炎治疗作用的差异,并进行相关药效动力学分析;4.采用LPS刺激小鼠巨噬细胞构建炎症细胞模型,加入不同剂量的药物,单用穿心莲内酯组每孔分别加入不同剂量穿心莲内酯(穿心莲内酯的终浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μmol/L);单用阿奇霉素组每孔加入不同剂量阿奇霉素(阿奇霉素的终浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/L);联合用药组加入穿心莲内酯与阿奇霉素(按照2㑳1的比例,终浓度分别为5.9968μmol/L、2.9984μmol/L、1.992μmol/L、0.7496μmol/L、0.3748μmol/L、0.1874μmol/L、0.0936μmol/L)。给药后除空白组外30min后给予LPS刺激,4h后收集细胞上清液,用ELISA法检测其中IL-6的含量。结果1.根据文献检索发现,以穿心莲内酯磺化物为主要成分的制剂(喜炎平注射液)与阿奇霉素联用已广泛用于感染性肺炎的临床治疗,联合使用具有缩短治愈时间、降低不良反应、提高治疗效率等优势。2.体外药物敏感性实验(牛津管法)结果显示,穿心莲内酯浓度在0.0244~50μg/ml范围抑菌圈直径均小于1.1cm,表明其在该浓度范围内单用无抑菌作用;阿奇霉素浓度在0.0244~50μg/ml范围内抑菌圈直径在1.1~1.5cm,且其抑菌作用呈明显剂量依赖;两者联合使用,抑菌圈直径与单用阿奇霉素抑菌圈直径大小无显著差异,结果表明两药无体外抗菌协同作用。3.穿心莲内酯、阿奇霉素单用或联合使用对克雷伯菌引起的大鼠肺炎模型可见明显的体内治疗作用。与模型组比较,穿心莲内酯在给药第一天对TNF-α、IL-4、IFN-γ有显著抑制作用(p0.05),在给药第二天对IFN-γ有显著抑制作用(p0.05);治疗周期中,与模型组比较,穿心莲内酯AUC_(TNF-α)下降41.2%,AUC_(IFN-γ)下降42.93%,AUC_(IL-4)下降65.57%,AUCU_(IL-6)下降21%。阿奇霉素在给药第一天对IFN-γ有显著抑制作用(p0.05),但与模型组比较AUC_(IFN-γ)增长了14.7%,且在给药后对血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A的产生呈抑制、诱导、再抑制作用,这可能与阿奇霉素杀灭细菌后细菌碎片进一步激活免疫反应而诱导炎症因子产生有关。与模型组比较,联用低剂量组在给药第一天对IFN-γ和IL-4有显著抑制作用(p0.05),且AUC_(IFN-γ)下降10.4%,AUC_(IL-4)下降49.25%;与各单用组比较,联用低剂量组对TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10总释放量有进一步的抑制作用。与模型组比较,联用中剂量组给药第一天对IFN-γ有极显著抑制作用(p0.01),对TNF-α、IL-4、IL-6有显著抑制作用(p0.05),AUC_(IFN-γ)下降31.2%,AUC_(TNF-α)下降76%,AUC_(IL-4)下降66.73%,AUC_(IL-6)下降42%。与各单用组比较,联用中剂量组对TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17总释放量有进一步的抑制作用。与模型组比较,联用高剂量组在给药第一天对IFN-γ有极显著抑制作用(p0.01),对TNF-α、IL-4、IL-6有显著抑制作用(p0.05),在给药第二天对TNF-α和IFN-γ有抑制作用(p0.05),AUC_(IFN-γ)下降67.9%,AUC_(TNF-α)下降79%,AUC_(IL-4)下降18.58%,AUC_(IL-6)下降11%,与各单用组比较,联用高剂量组对各炎症因子的总释放量均有进一步的抑制作用。另与模型组比较,各给药组对IL-1β、IL-10和IL-17A三炎症因子有抑制作用趋势。但与各单用组比较,联用高剂量组对此三因子的总释放量也呈进一步抑制作用趋势。4.在造模第3天,空白组HE染色镜下未见明显组织病理损伤,其余6组呈间质性肺炎特征。均表现为肺泡中隔显著增厚,轻度淤血以及炎性细胞浸润。支气管腔内有少量炎性细胞以及脱落坏死的支气管上皮细胞,多量炎性细胞环绕血管或支气管形成“管套”现象,局部区域固有结构消失、多量上皮细胞增生伴随多量炎症细胞浸润,部分支气管腔内见有较多量的红细胞。给药第3天,镜下可观察空白组肺组织未见明显病理损伤,模型组肺组织呈化脓性肺炎样表现,各给药组样本表现为不同程度的肺泡隔增宽、肺泡壁毛细血管扩张充血、终末支气管内蛋白及细胞碎片等病理损伤。但联合用药组与单用组病理学变化无显著组间差异。5.经ELISA法检测巨噬细胞释放IL-6含量时,穿心莲内酯的浓度在1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM下,能够抑制在炎症反应时巨噬细胞释放IL-6;阿奇霉素在0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM和10μM浓度下,能够抑制巨噬细胞释放IL-6。而穿心莲内酯与阿奇霉素给药剂量为2:1时,在浓度为1.847μM、3.748μM、7.496μM、14.992μM和29.984μM范围内,对IL-6有抑制作用。计算对IL-6抑制率为5%、10%、20%、40%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%下的CI值,各CI值分别为9.728、6.098、3.766、2.201、1.480、1.216、1.095、0.976、0.856、0.730、0.693,表明两者药物在低联用剂量区间呈现拮抗作用,联用剂量在1.085~1.251μM范围内呈加和作用,联用剂量大于1.251μM时呈协同作用。结论1.中西药联合使用对感染性肺炎治疗效果确切,具有临床应用优势;2.穿心莲内酯虽无协同阿奇霉素的抗菌作用。但穿心莲内酯联用阿奇霉素相比两者的单独使用,能够进一步抑制细菌感染性肺炎大鼠血清中的多种炎症因子生成,表明合用能发挥协同抗炎作用,从而显著改善肺炎症状。同时阿奇霉素单用数据提示,抑菌后细菌构件可能诱发机体更为强烈的免疫反应;合用穿心莲内酯后,对这一现象有改善作用。细胞实验表明合用在高剂量区间,穿心莲内酯合用阿奇霉素具有抗炎协同作用。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563.1
【图文】：

高效液相色谱,穿心莲内酯,高效液相色谱

DIKMA 公司）；检测波长：225nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；流动相：甲醇：水=60:40.图 1.1 穿心莲内酯高效液相色谱图1.1.2 受试菌株肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）临床分离株，于 2016 年 10 月从四川省中医院（成都中医药大学附属医院，三级甲等）住院患者痰液中分离得到。该菌株在分离单位经 Vitek60 和 Viket32 全自动细菌分析仪（法国生物梅里埃公司）鉴定，确定为肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）。经分离得到的细菌涂抹于 MH-A 平板表面，37℃恒温孵育过夜，待长出菌团后，选择长势良好的菌团涂布于新鲜 LB 琼脂平板表面增菌，相同孵育条件至

成都中医药大学,牛津,硕士学位论文,抑菌圈

成都中医药大学 2019 届硕士学位论文的平板盖上培养皿盖后，小心放入 37℃孵育箱将牛津管取出后，测量各组抑菌圈大小。含有 DMSO 不含药，抑菌圈直径为 1.1cm，其见表 1-4.

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