香烟提取物通过周期蛋白D1促进支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖

发布时间：2020-06-26 02:21

【摘要】： 目的： 支气管哮喘(简称哮喘)是当今世界最常见的慢性疾病之一，目前国、内外的研究认为，哮喘的本质是气道慢性炎症，并在此基础上出现气道高反应性和气道重构。而气道平滑肌的增殖在哮喘气道重构中起着重要作用，是不可逆性气流阻塞、持续气道高反应性的重要病理基础。但是，哮喘气道平滑肌增殖的调控机制目前尚不十分清楚。 吸烟是影响哮喘发生、发展的重要危险因素，它可以增加哮喘发生频率和症状严重程度。目前研究发现，吸烟可以降低皮质激素对哮喘患者的治疗效果。香烟烟雾中含有6000多种化学物质，其中多种物质有毒。香烟烟雾能增加卵白蛋白致敏豚鼠气道急性变应性炎症。我们以往的研究发现，香烟提取物(CSE)可以促进哮喘大鼠气道平滑细胞(ASMCs)的增殖，但其具体机制尚未阐明。 国内外研究表明，细胞分裂及细胞数量的增加要通过细胞周期，在细胞周期中必须有细胞周期蛋白的参与，这种蛋白对细胞周期起调控作用。而D1类细胞周期蛋白(cyclinD1)是调节细胞周期G_1期向S期转变的关键因子，参与众多细胞周期的调控。CSE是否通过cyclinD1参与调控ASMCs增殖，目前相关研究报道尚少见。 本实验通过建立哮喘大鼠模型，体外培养ASMCs，在细胞水平研究CSE对ASMCs的增殖作用、对cyclinD1表达的影响以及PKC-cyclinD1信号通路是否参与CSE促ASMCs的增殖过程，探讨CSE促进ASMCs增殖的可能机制。为进一步深入了解哮喘的发病机制，寻找有效的治疗方法提供理论依据。 方法： 1建立大鼠哮喘模型，原代培养大鼠ASMCs。用CSE和细胞周期蛋白依赖激酶-4抑制剂GW8510干预哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达。研究CSE对ASMCs的增殖作用以及对cyclinD1表达的影响。 2建立大鼠哮喘模型，原代培养大鼠ASMCs。用CSE和cyclinD1反义表达质粒干预哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达。研究CSE和cyclinD1反义表达质粒对ASMCs增殖的干预作用。 3建立大鼠哮喘模型，原代培养大鼠ASMCs。用CSE和PKC激动剂PMA以及抑制剂Ro-31-8220干预哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测cyclinD1和PKC-α的表达。探讨PKC-cyclinD1信号通路是否参与CSE促ASMCs的增殖。 结果： 1．与对照组ASMCs相比，CSE处理组G_0／G_1期细胞所占比例明显减少，S+G_2M期细胞所占比例明显增高，吸光度A值、PCNA阳性表达率明显增高。cyclinD1 mRNA和蛋白的表达明显增加。哮喘组与对照组相比，G_0／G_1期细胞所占比例明显减少，S+G_2M期细胞所占比例明显增高，吸光度A值、PCNA阳性表达率明显增高。cyclinD1mRNA和蛋白的表达明显增加。经GW8510干预后，哮喘组ASMCs G_0／G_1期细胞所占比例明显增高，S+G_2M期细胞所占比例明显降低，吸光度A值、PCNA阳性表达率明显降低。cyclinD1 mRNA和蛋白的表达明显减少。 2．反义质粒组与对照组相比，G_0／G_1期细胞所占比例明显增高，S+G_2M期细胞所占比例明显降低，吸光度A值、PCNA阳性表达率明显降低。cyclinD1 mRNA和蛋白的表达明显减少。CSE组与CSE+反义质粒组相比其G_0／G_1期细胞所占比例明显减少，S+G_2M期细胞所占比例明显增高，吸光度A值、PCNA阳性表达率明显增高。cyclinD1mRNA和蛋白的表达明显增加。 3．与CSE组相比，Ro-31-8220处理组G_0／G_1期细胞所占比例明显增高，S+G_2M期细胞所占比例明显降低，吸光度A值、PCNA阳性表达率明显降低。cyclinD1，PKC-αmRNA和蛋白的表达明显减少。CSE+PMA组和CSE+PMA+反义质粒组相比其G_0／G_1期G_0／G_1期细胞所占比例明显减少，S+G_2M期细胞所占比例明显增高，吸光度A值、PCNA阳性表达率明显增高。cyclinD1，PKC-αmRNA和蛋白的表达明显增加。 结论： 1．哮喘大鼠ASMCs增殖活性明显增强，CSE可以促进哮喘大鼠ASMCs增殖，cyclinD及其亚型cyclinD1在哮喘大鼠ASMCs的增殖中发挥了重要的作用。 2．cyclinD1反义表达质粒可以抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖，即使再用CSE刺激，也不能明显改善ASMCs增殖能力，CSE可能是通过作用于cyclinD1来影响ASMCs的增殖。 3．PKC信号通路可能参与了CSE促进哮喘大鼠ASMCs的增殖作用，PKC可能是通过cyclinD1调控哮喘大鼠ASMCs增殖。CSE促进哮喘大鼠ASMCs增殖可能是通过PKC-cyclinD1级联反应引起的。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R562.25

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本文编号：2729678