大剂量过敏原诱导致敏小鼠T细胞不反应性及机制研究

发布时间：2020-06-30 18:11

【摘要】： 支气管哮喘(哮喘)是一种由多种炎症细胞参与的慢性气道变应性炎症性疾病,其发病机制尚未完全阐明[1-3]。Th2细胞的过度活化导致了Th2反应为主的免疫反应,Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的气道炎症发生发展中起关键作用[3-5]。目前研究发现,“Th1/Th2偏移”假说不能完全解释哮喘的免疫学机制异常[6-10],近年又提出了“免疫耐受缺陷”的假说。正常人接触过敏原后不会发生Th2细胞的过度活化,这是因为正常人可以对过敏原产生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷导致接触过敏原后T细胞异常活化,增殖和分化为Th2细胞,引起“Th1/Th2偏移”,始动哮喘的气道炎症。“免疫耐受缺陷”的假说从更深的层次解释了哮喘发病的免疫学异常,可能是哮喘发病的重要机制。过敏原特异性免疫治疗(SIT)是目前已知唯一针对哮喘病因的治疗方法,它在一定程度上可以改善这种免疫耐受的缺陷,但其作用机制目前尚不完全清楚[11-12]。近年来研究发现,成功的SIT,调节性T细胞(Tregs)的诱导产生起重要作用[11-15]。哮喘体内Tregs功能的异常和分化数量的减少,在哮喘的变应性气道炎症中起重要作用[16-19]。调控Tregs的具体机制目前尚不清楚。研究发现,抑制性细胞因子IL-10和TGF-β、Notch信号均与诱导调节性T细胞的产生有关[20-23]。既往研究显示大剂量过敏原在体外可诱导致敏小鼠T细胞不反应性[24]。大剂量过敏原是通过何种机制诱导致敏小鼠T细胞不反应性目前尚不清楚。为此,本实验观察了不同浓度OVA对致敏小鼠Th1/Th2细胞因子分泌的作用,以及大剂量OVA体外处理分别对IL-10和TGF-β分泌的作用,对DC表面共刺激信号表达的作用、对Tregs极化的作用、对T-bet和GATA3表达以及Notch信号表达的作用,以研究其诱导T细胞不反应性的具体机制。研究内容和方法: 1.复制致敏小鼠模型,并分离培养致敏及正常对照小鼠脾脏DC和T细胞。 2.不同浓度的OVA体外处理致敏和正常对照小鼠脾脏DC和T细胞,ELISA检测Th1/Th2细胞因子的分泌情况,不同浓度的过敏原体外处理致敏和正常对照小鼠脾脏DC,ELISA检测IL-10,TGF-β1的分泌水平,并分析与Th1/Th2因子的相关性。 3.流式检测致敏及正常对照小鼠脾脏DC表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86表达。致敏小鼠脾脏DC与10mg/ml OVA或生理盐水共培养后,流式检测并比较CD80、CD86等共刺激分子的表达。 4.分离小鼠CD4+T细胞,流式检测致敏小鼠和正常对照小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量。致敏小鼠脾脏DC、CD4+T细胞与10mg/ml OVA或生理盐水共培养后,流式检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量。 5. RT-PCR和Western blotting法分别检测致敏小鼠和正常对照小鼠T细胞转录因子T-bet和GATA3的mRNA及蛋白表达水平。致敏小鼠脾脏DC、CD4+T细胞与10mg/ml OVA或生理盐水共培养后,RT-PCR和Western blotting法分别检测T-bet和GATA3的mRNA及蛋白表达。 6. RT-PCR和Western blotting法分别检测致敏小鼠和正常对照小鼠DC和T细胞Notch配体和受体的mRNA及蛋白表达水平。致敏小鼠脾脏DC、T细胞与10mg/ml OVA或生理盐水共培养后,RT-PCR和Western blotting法分别检测Jagged1和Notch3表达。 7.分离培养小鼠骨髓DC,流式检测表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86表达。 8.应用脂质体Lipofectamine2000将Notch配体Jagged1转染小鼠骨髓DC。RT-PCR和Western blotting法检测转染DC中目的基因表达状况。 9. Jagged1转染DC与空质粒转染DC分别与致敏小鼠CD4+T细胞共培养后,流式检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量。结果: 1.在0~1mg/ml浓度范围内,致敏小鼠Th2细胞因子的分泌随处理浓度增高而增高,但在10mg/ml的OVA作用下,IL-4、IL-5等细胞因子的分泌水平则较其他组明显降低(p0.05)。IL-2和IFN-γ的分泌也受到明显抑制(p0.05)。而对正常对照小鼠T细胞,OVA浓度的变化对其Th1/Th2细胞因子的分泌无影响。 2.在0~10mg/ml浓度范围内,致敏小鼠分泌IL-10,TGF-β1水平随处理浓度增高而增高,正常对照小鼠各浓度处理组之间无显著差异。致敏小鼠Th1/Th2细胞因子水平与IL-10和TGF-β1水平无明显相关性。 3.致敏小鼠脾脏DC表面共刺激分子CD80、CD86、MHCII表达显著高于正常对照小鼠。10mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠脾脏DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达明显降低。 4.致敏小鼠脾脏细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量显著低于正常对照小鼠。10mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量显著上升。 5.致敏小鼠T细胞T-bet的mRNA及蛋白表达较正常对照小鼠显著降低,而GATA-3的表达较正常对照小鼠显著升高。大剂量过敏原(10mg/ml的OVA)作用下致敏小鼠T细胞T-bet的mRNA和蛋白表达水平较对照组显著降低,GATA-3的mRNA和蛋白表达水平较对照组显著降低。 6.致敏小鼠脾DC Notch配体Jagged1、Jagged2以及Delta1 mRNA的表达较正常对照小鼠显著降低,而Delta3、Delta4 mRNA的表达则与正常对照小鼠相比无显著差异。致敏小鼠T细胞Notch受体Notch1、Notch3 mRNA的表达较正常对照小鼠显著降低,而Notch2, Notch4 mRNA的表达则与正常对照小鼠相比无显著差异。大剂量过敏原(10mg/ml的OVA)体外处理后致敏小鼠DC Jagged1和T细胞Notch3的mRNA表达均较对照组显著增加。 7.致敏小鼠脾脏DC Jagged1蛋白表达及T细胞Notch3蛋白表达均显著低于正常对照小鼠。大剂量OVA体外处理后Jagged1及Notch3蛋白表达水平显著上升。 8. RT-PCR半定量法及Western Blotting证实Jagged1转染骨髓DC内有转染基因mRNA及蛋白表达。 9.致敏小鼠CD4+T细胞经Jagged1转染DC处理后,CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量增多。结论: 1.大剂量过敏原在体外可诱导致敏小鼠T细胞的不反应性,其机制与降低致敏小鼠DC共刺激分子表达,诱导调节性T细胞极化等有关。 2.致敏小鼠DC/T细胞Notch信号配体/受体表达有明显的降低。大剂量过敏原在体外作用可上调其表达。Jagged1转染DC能够诱导调节性T细胞极化。以上提示Notch信号途径的“缺陷”可能是调节性T细胞极化不足的重要原因。本文的结果证明,大剂量过敏原可以恢复变应原致敏T细胞的免疫耐受,给特异性过敏原免疫治疗提供了充实的理论依据。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R562.25
【图文】：

共刺激分子,脾脏,表面

10mg/ml 的 OVA 作用后，致敏小鼠脾脏 DC 表面共刺激分子 CD80、CD86 的表达分别由 35.46+6.76％、67.83+5.72％减少至 21.94+5.00％、44.36+3.44％（p<0.05）（图3 及图 4）。

脾脏,共刺激分子,表面

10mg/ml 的 OVA 作用后，致敏小鼠脾脏 DC 表面共刺激分子 CD80、CD86 的表达分别由 35.46+6.76％、67.83+5.72％减少至 21.94+5.00％、44.36+3.44％（p<0.05）（图3 及图 4）。图 1 小鼠脾脏 DC 的 CD11c 表达

【参考文献】