哮喘气道杯状细胞特有hCLCA1的体外表达及自裂解分泌型形式的鉴定

发布时间：2020-07-02 14:34

【摘要】：【研究背景】 哮喘的临床特征表现为气道高反应性和气道黏液高分泌，慢性非特异性气道炎症是哮喘重要的发病机制。黏液高分泌是哮喘患者肺功能下降，以及致死性哮喘发生的因素之一，但目前临床尚缺乏抑制黏液高分泌的手段。气道上皮杯状细胞数量增多是黏液高分泌的病理基础，探讨杯状细胞的病变机制是控制该临床症状的突破口。已有的研究证实，人钙激活氯离子通道I型（human calcium-activated chloridechannel1，hCLCA1）作为新生杯状细胞的特异性表达蛋白，通过调控黏蛋白5AC（Mucin5AC,MUC5AC）的合成，在气道黏液合成及分泌过程中扮演了重要角色。hCLCA1和小鼠钙激活氯离子通道III型Murine calcium-activated chloride channel type3,mCLCA3)是异种同源蛋白，分别在各自的物种气道黏液高分泌中起着关键作用。早期人们认为它们是一种跨膜通道离子蛋白，但近年国外的研究小组发现，mCLCA3和hCLCA1是分泌型蛋白，可以自裂解为N端的75kD和C端的35kD的两个独立结构，可能N端能作为独立的个体行使全长的功能，通过对膜氯离子通道蛋白的调控作用，来实现对黏液蛋白合成与分泌的调节。同时，钙激活氯离子通道（Calcium-activated chloride channel，CLCA）与气道炎症的形成也存在密切的关系，甚至可能互为因果。体外表达和纯化hCLCA1是进一步研究该蛋白功能的基础和前提，同时，进一步验证hCLCA1的存在形式有利于揭示该蛋白的作用机制。 【目的】 观察hCLCA1在离体的上皮细胞模型NCI-H292细胞中的表达及分泌情况，探讨hCLCA1作为气道炎症介质的可能性。本课题组前期的动物实验已经证实mCLCA3对小鼠哮喘模型的炎症及黏液分泌具有促进作用，mCLCA3的抗体可以阻断哮喘小鼠模型的炎症进程，对炎症的发展有一定的阻断作用。本实验对mCLCA3的异种同源蛋白hCLCA1的N端的蛋白在大肠杆菌内诱导表达，并进行了其N端功能结构区蛋白纯化及鉴定，为进行下一步的蛋白功能研究做准备。通过将hCLCA1过表达慢病毒感染NCI-H292后，收集上清及细胞沉淀，进行western blotting验证，观察hCLCA1在离体人上皮细胞中的合成及自裂解，为hCLCA1在人气道黏液高分泌症状中扮演的角色进行初步研究。 【方法与结果】 1．成功构建hCLCA1全长的真核及N端的原核质粒。⑴将N端约2200bp目的片段插入pET28a载体，用SalI及Xhol1对重组质粒进行双酶切，得到大小为2200bp的片段，与预期结果相符。测序表明重组质粒pET28a(+)/hCLCA1-N构建成功。⑵将hCLCA1全长基因约2935bp目的片段插入pEGFP-N1载体，用SalI及BglII对重组质粒进行双酶切，得到大小为2935bp的片段，与预期结果相符。测序重组质粒EGFP-N1(+)/hCLCA1构建成功，可以进行下一步的转染试验。⑶利用转染试剂Tuberfect在HEK293细胞中转染EGFP-N1(+)/hCLCA1重组质粒，细胞转染后不同时间观察绿色荧光蛋白表达。结果显示hCLCA1可以在NCI-H293细胞中成功表达。24h后取出细胞爬片，利用DAPI进行核染色观察细胞定位。结果显示GPF-hCLCA1在细胞核周围的细胞器中表达量较高。 2．hCLCA1-N蛋白的诱导表达、纯化及鉴定。⑴诱导pET28a(+)/hCLCA1-N转化的BL21菌株，经筛选获得最佳表达时间（5h）、温度（30℃）、浓度（0.5mmoL/L）。⑵以最佳条件进行蛋白诱导表达，在冰上进行充分的超声裂解，分别对收集到的上清、沉淀样品进行凝胶电泳检测。实验表明，我们的目的蛋白大多数存在沉淀样品中，约占80％。⑶对蛋白进行His镍柱纯化，SDS-PAGE电泳显示获得纯度较高的目的蛋白, Western blotting在70kD分子量大小附近有一条明显条带；而在未诱导细菌总蛋白中无该条带。结果显示，所纯化的Hish-hCLCA1-N融合蛋白正确，为下一步实验的hCLCA1的单克隆抗体制备及后续的抗体干预细胞功能提供了条件。 3．对hCLCA1进行了慢病毒载体的包装并感染NCI-H292细胞。⑴将慢病毒包装辅助质粒与穿梭质粒经转染试剂Turbofect转染HEK293细胞，免疫荧光结果显示48h后HEK293细胞的表达情况良好，转染效率较高。⑵收集病毒上清，感染NCI-H292细胞48h后，收集细胞及上清做Western Blotting检测，结果显示在细胞上清中可以检测到60KD的蛋白，在细胞中检测到60KD及130KD左右的蛋白，去除EGFP片段大小后说明hCLCA1蛋白可以在NCI-H292细胞内自裂解为N端和C端两个独立结构。这为后期将分泌的上清蛋白进行上皮细胞及淋巴细胞的趋化及黏附功能的研究打下基础。 【结论】 1．本实验合成了人的hCLCA1-N段胞外活性肽段，进行了蛋白的原核表达和纯化，为后期针对人hCLCA1的抗原合成打下了基础。 2．为了观察hCLCA1在上皮细胞中的合成及其是否在胞内裂解且分泌到胞外，我们对hCLCA1进行病毒载体包装后感染NCI-H292细胞，感染效率高，约为60%以上。 3.在用病毒包装载体感染NCI-H292细胞后，进行了蛋白细胞内的定位，发现hCLCA1可以在人呼吸道上皮细胞的体外模型中发生自裂解，且能分泌到细胞外起作用，可能会在哮喘呼吸道上皮的非特异性炎症起一定的作用。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562.25

【参考文献】

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1 吴文丽;甄宏韬;崔永华;褚汉启;王丽芬;;钙激活氯通道和黏蛋白在变应性鼻炎中的表达与意义[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2010年05期

本文编号：2738312