一种基于TCRPs的NETosis新型分析模型及其在肺上皮损伤中的功能探究

发布时间：2020-07-03 07:04

【摘要】：NETosis,是指中性粒细胞释放胞外捕获网(Neutrophil Extracellular Traps,NETs)的动态过程,是一种新型的杀菌机制。当中性粒细胞受到微生物或其他因素刺激后,胞体从球状变成扁平,核膜、胞膜相继崩解破裂,DNA等核酸物质和胞浆颗粒蛋白融合,继而释放到胞外,形成可以捕杀细菌的纤维网状结构物质。由于NETs包含高浓度蛋白水解酶,过量的NETs释放不可避免导致宿主组织损伤。急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是各种致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,继而造成急性低氧性呼吸功能不全,发病率及致死率较高。已有研究发现急性肺损伤的发病与大量中性粒细胞活化并积聚在肺组织有关,且急性肺损伤患者外周血具有较高浓度游离DNA。然而,活化的中性粒细胞的组织毒性是否与其释放NETs有关,以及缓解NETs释放是否能减轻肺组织损伤,还有待进一步阐明。而且临床上尚缺乏治疗急性肺损伤的针对性药物。基于电微阻抗的实时细胞分析(Real Time Cell Analysis,RTCA)系统可以监测到特定的靶细胞应对外界多种刺激时的时间剂量依赖性反应图谱(Time-dependent Cell Response Patterns,TCRPs)。在本研究中,我们运用xCELLigence实验仪器,基于TCRPs技术构建了 一套新型的动态评估NETosis的方法:首先在RTCA系统上根据不同细胞密度的生长曲线差异优化建立稳定的肺上皮屏障,然后在肺上皮屏障的细胞平台期时加入待检测的不同处理条件下的中性粒细胞,通过中性粒细胞与肺上皮细胞共培养状态下二者之间的相互作用使微阻抗信号发生改变从而动态反映中性粒细胞的状态,其TCRPs图谱结果表明LPS激活的中性粒细胞破坏肺上皮细胞骨架、促使细胞凋亡从而诱导上皮屏障损伤,细胞指数(Cell Index,CI)呈现下降趋势。接下来,将体外提取的NETs于平台期加入肺上皮屏障中也可观测到类似的CI下降及细胞损伤效应。为进一步研究,活化的中性粒细胞对肺上皮细胞的毒副作用是否与其释放NETs的能力有关,我们运用NADPH酶抑制剂DPI预处理中性粒细胞来阻滞NETosis过程,通过比较TCRPs发现,区别于LPS激活的中性粒细胞造成严重的肺上皮CI下降,DPI预处理的中性粒细胞对肺上皮的损伤效应明显遏制,CI下降趋势明显缓解。由此,我们得出结论激活态中性粒细胞释放NETs是其具有细胞毒作用的原因之一,且基于TCRPs的分析技术通过动态监测肺上皮屏障的CI趋势改变可以实时反映NETosis的诱导/阻滞进程。我们所建立的这种基于TCRPs的NETosis动态分析模型可以定性定量分析不同处理条件下或不同样本来源的中性粒细胞所造成的上皮损伤效应的差异,从而分析其释放NETs水平的不同。接下来我们想深入探究目前创建的这种方法是否在ALI的疾病诊断和治疗上是否有临床应用价值。ALI的主要病因是肺部炎症和感染,因此我们选定的疾病人群是肺炎患者。通过比较静脉血液样本,我们发现,与健康对照组相比,重症肺炎患者外周血中性粒细胞对肺上皮损伤更严重,造成的上皮CI下降趋势更明显,与其释放NETs的能力更剧烈有关,这与其他常规的NETs检测方法的验证结果一致。中性粒细胞释放NETs的能力与炎症环境下中性粒细胞受到炎性刺激有关,因此我们尝试检测糖皮质激素及几种常见非甾体抗炎药物对NETosis 阻滞作用,TCRPs结果显示阿司匹林和对乙酰氨基酚可显著抑制NETs释放,缓解中性粒细胞对肺上皮的损伤效应,与前人研究结果一致,进一步证明了基于微电子阻抗动态监测NETosis体系的可行性,同时也表明我们所创建的NETosis动态分析模型具有潜在的临床应用价值。总之,我们运用xCELLigence仪器基于TCRPs技术所建立的NETosis实时分析模型与传统方法相比,具有无标记、动态连续、高通量的优势,为定性定量评估中性粒细胞以及中性粒细胞释放的NETs对宿主肺上皮组织的损伤效应以及解释ALI的发病机制提供了新的工具,且便于后续临床开拓广泛用于疾病诊断及筛选抑制NETs释放的药物,有助于推动ALI的治疗进展。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563
【图文】：

本课题所采用的是ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ实时无标记细胞分析（ＲＴＣＡ）邋ＳＰ仪器（如逡逑图１示），该系统配套的监测组件是实时微电子捡测板，即一个底部整合有微电逡逑子芯片的Ｅ－９６孔板（如图２示）。将仪器被放置于标准的Ｃ０２培养箝中，通过电逡逑缆接口与在外部的分析和控制单元进行连接，利用电子阻抗值来记录细胞的行为逡逑变化，在屏幕实时显示ＴＣＲＰｓ图谱。逡逑ｒｍ逡逑通灥■逡逑■逦■■■■里蜃逡逑图２．邋ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ实时无标记细胞分析仪逦图３．邋Ｅ－ｐｌａｔｅ邋９６细胞培养板逡逑５逡逑

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本文编号：2739353