依达拉奉对脂多糖内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用及分子机制研究

发布时间：2020-07-04 12:32

【摘要】： 急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是以肺内弥漫性炎症细胞浸润、肺组织循环障碍、肺毛细血管通透性增加及低氧血症为特征的常见临床综合征,预后差、病情凶险,可迅速进展为多脏器功能衰竭,病死率为30%～70%,防治本类疾病具有非常重要的临床意义。虽然国内外已进行了大量的实验与临床研究,但仍未完全阐明ALI病理演变过程及发病机制,且药物治疗效果不佳,常以小潮气量保护性机械通气来降低死亡率。 初步使用的ALI治疗药物有血管舒张剂的吸入治疗(一氧化氮吸入、前列环素吸入及外源性肺表面活性物质等)、肾上腺糖皮质激素、非甾体类抗炎药物、酮康唑(ketoconazole)等,但存在疗效不满意或严重的不良反应等问题,因此,迄今尚无强力的、安全有效的药物治疗手段。 目前对有关中性粒细胞肺内扣押、过度激活及导致肺微血管通透性增高的机制和相应信号调控机制的早期药物干预正成为寻找ALI抗炎治疗药物的重要手段。研究认为,氧自由基(Oxygen free radicals,OFR)损伤是中性粒细胞聚集、跨膜迁徙、活化后引起肺实质和肺微血管损害等过度失控的炎症反应的最主要机制之一。抗氧化剂逐步纳入我们的视线。ALI时,活化的中性粒细胞和肺泡巨噬细胞以及肺泡上皮细胞产生超大量的活性氧类,包括羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢等,导致蛋白核酸变性和生物膜破坏,并且促使更进一步中性粒细胞聚集而导致肺损伤的恶性进展。 依达拉奉(edaravone,MCI-186),化学名:3-甲基-1-苯基-吡唑啉-5-酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one),是日本三菱制药公司研发,2001年6月在日本上市,迄今为止,依达拉奉是全球进入三期临床使用的最新型强抗氧化剂,具有强大的自由基清除作用,临床已经有效用于治疗急性脑梗塞。近来动物研究发现,依达拉奉能降低毛细血管壁的通透性、改善微循环、具有强大的细胞保护作用及抑制溶酶体的释放等抗炎效应,提示着依达拉奉可能具有治疗ALI的作用。目前尚未发现依达拉奉对ALI模型保护作用的病理生理和分子机制多层面综合研究报道。因此,本研究将选用脂多糖内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导ALI大鼠在体模型,拟从整体的病生指标、分子水平综合性将新型抗氧化药物依达拉奉对ALI的保护作用及机制进行研究,旨在从抗氧化药物途径上为依达拉奉治疗ALI提供基础实验依据。 本研究的第一、第二章主要从肺部炎症反应的病理形态学、肺气体交换能力、肺组织通透性、中性粒细胞活化扣押、氧化/抗氧化系统指标、肺毛细血管内皮细胞的超微结构等角度,多角度验证新型抗氧化剂依达拉奉是否对ALI具有保护作用。基于核因子κB(nuclear factor ofκB,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导路径在ALI发病机制中的重要作用和密切关系,我们研究的第三、第四章主要从分子水平来验证新型抗氧化剂依达拉奉对ALI的保护作用是否与抑制MAPK信号通路上的关键蛋白MAPK的三个家族成员p38MAPK、JNK(c-Jun N-terminal kinase)、ERK(extracellularsignal-regulated kinase)蛋白激酶和NF-κB信号通路的关键蛋白NF-κB的活化相关。 LPS诱导ALI模型的制作和分组:依据参考文献和预实验来确定和验证ALI模型的制作,选择雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(Ⅱ级清洁等级),从尾静脉迅速推注LPS(5mg/kg),使氧和指数＜300,6小时后配置10%水合氯醛经腹腔注射麻醉后再行进一步操作。依据随机数字表将入选的SD大鼠分成6组(每组8只):(1)正常对照组(A组);(2)LPS致伤组(B组);(3)LPS+Edaravone高剂量组(C组);(4)LPS+Edaravone中剂量组(D组);(5)LPS+Edaravone低剂量组(E组);(6)阳性对照LPS+地塞米松(DEX)组(F组)。B、C、D、E、F组大鼠各依照参考文献制作ALI模型;正常对照的A组经尾静脉注入生理盐水,余组皆注入LPS(5mg/kg),此外,在LPS注入得前30分,LPS造模的B组注射等容积的生理盐水;C组注射等容积的Edaravone溶液(3.0mg/kg);D组注射等容积的Edaravone溶液(1.0mg/kg);E组注射等容积的Edaravone溶液(0.3mg/kg);F组注射等容积的DEX溶液(3mg/kg)。 目的: 探讨依达拉奉对脂多糖内毒素诱导ALI大鼠的保护作用及分子机制,旨在从新的抗氧化药物途径上为治疗ALI提供基础实验依据。 方法: 第一章依达拉奉对脂多糖内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用及病生机制分析:测定多项动脉血气指标,肺通透性指数(lung permeability index,LPI)、肺含水量、湿/干重(wet to dry weight ratio,W/D)比值及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白含量,光镜、电镜观察肺组织病理形态变化。 第二章依达拉奉对脂多糖内毒素急性肺损伤中性粒细胞肺内扣押与氧自由基损伤的抑制作用:测定各组支气管肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)计数比例,测定肺组织、血清中的髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。 第三章依达拉奉对脂多糖内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺组织NF-κB活性的影响:采用蛋白免疫印迹法(Lowry法和Western blot法)检测肺组织磷酸化NF-κB的表达。 第四章依达拉奉对脂多糖内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺组织MAPKs(p38,JNK,ERK)活性的影响:采用蛋白免疫印迹方法(Lowry法和Westernblot法)分三节分别测定肺组织磷酸化p38MAPK、JNK、ERK的表达。 结果: 第一章:依达拉奉能显著降低ALI大鼠动脉血PaCO_2值、肺通透性指数、肺水含量、肺湿/干重比值、BALF中的蛋白含量(P＜0.05),提高ALI大鼠动脉血PaO_2值、氧和指数及PH值(P＜0.05),并显著减轻ALI大鼠肺微血管内皮细胞损伤,改善肺部炎症病理改变,依达拉奉对内毒素诱导ALI大鼠保护作用呈一定得剂量-效应关系。 第二章:依达拉奉显著降低ALI大鼠支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数、肺组织中丙二醛含量、髓过氧化物酶活性和血清中丙二醛含量、乳酸脱氢酶活性,显著提高肺组织和血清中的超氧化物歧化酶活性(P＜0.01,或P＜0.05),并且,依达拉奉对内毒素诱导急性肺损伤氧自由基损伤和中性粒细胞肺内扣押的抑制作用呈一定得剂量-效应关系。 第三章:LPS诱导ALI模型组大鼠的肺组织磷酸化NF-κB的表达比正常对照组显著升高(P＜0.01),而与LPS诱导ALI模型组比,依达拉奉高、中剂量组能显著抑制大鼠肺组织磷酸化NF-κB的表达(P＜0.01及P＜0.05),并呈剂量-效应关系。 第四章:LPS诱导ALI模型组大鼠的肺组织磷酸化p38MAPK、JNK、ERK的表达比正常对照组显著升高(P＜0.01),与LPS诱导ALI模型致伤组相比,依达拉奉高剂量组和中等剂量组均能显著抑制大鼠肺组织磷酸化p38MAPK、JNK,ERK的表达(P＜0.01和P＜0.05)。 结论: 依达拉奉能减轻LPS诱导ALI微血管屏障破坏,提高肺部气体交换功能,强力抑制ALI的肺部炎症反应和通透性增高;能发挥出抑制ALI中性粒细胞肺内扣押、聚集及减轻继发的脂质过氧化反应产生的严重损害,迅速扭转氧化/抗氧化平衡系统的失调;从分子机制分析,依达拉奉对LPS诱导ALI的保护作用与依达拉奉抑制LPS诱导NF-κB的过度活化存在密切联系;同时,依达拉奉也参与阻断ALI炎症反应另一信号转导途径.MAPKs的三个关键蛋白激酶(P38MAPK,ERK和JNK)的磷酸化,从炎症链的上游瓶颈处阻断ALI炎症级联反应的激化和继发性损害。进入三期临床的新型强抗氧化剂——依达拉奉有可能成为抗氧化抗氧化途径治疗ALI新的药物选择,本研究为此提供了基础实验依据。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R563
【图文】：

光镜下(x400倍)观察:A组为正常对照组，大鼠肺组织，肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡壁及间质内无炎性细胞浸润

光镜下(x40o倍)观察:D组为依达拉奉中剂量组，肺组织轻度水肿，见多量炎症细胞浸润，部分肺泡结构破坏

【引证文献】

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1 李榜龙;探讨抗氧化剂对人血管内皮细胞炎症反应的干预作用[D];南华大学;2010年

本文编号：2741132