小鼠动物模型在哮喘气道高反应治疗和抗流感药物筛选中的应用研究

发布时间：2020-07-06 11:14

【摘要】：随着环境和生活方式的改变,支气管哮喘发病率逐年增加,而以流感为代表的病毒感染引起的非过敏性哮喘也逐渐增多,且常规的皮质类药物对此疗效甚微,因此亟需研究病毒感染等引起的非过敏性哮喘发病过程,寻找潜在治疗方法。同时,流感作为多发的呼吸道疾病,在全球范围内危害较大,目前用于治疗流感的药物主要为神经氨酸酶抑制剂和基质蛋白2 (Matrix protein 2, M2)离子通道阻断剂,但两类药物均存在耐药性逐渐增强和毒副作用等缺点,因此迫切需要研发和评价新型高效抗流感药物。本论文由两部分研究组成。第一部分通过建立H1N1亚型流感病毒诱导小鼠哮喘气道高反应(Airway Hyper-reactivity, AHR)模型,寻找潜在的治疗非过敏性哮喘的有效方法。首先将HlN1亚型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)以1.5×103EID5o剂量滴鼻接种小鼠,发现小鼠肺脏内病毒在3dpi达到高峰,约为107EID50/g；呼吸道症状明显,组织病理学变化显著；小鼠血清抗体显著上升;且在5dpi时经乙酰甲胆碱刺激后肺阻力(lung resistance, RL)值可达到基础值的325%,形成典型的气道高反应(Airway Hyper-reactivity, AHR)症状,与公认的过敏性卵清蛋白(Ovalbumin)哮喘气道高反应相似。同样剂量感染Rag2-/-基因敲除小鼠,在感染5天后,Rag2"/-基因敲除小鼠也出现典型的AHR症状。同时发现,支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BAFL) IL-5和IL-13水平显著升高。通过流式细胞技术检测发现,PR8感染Rag24-小鼠后,肺脏ILC2阳性细胞比例为13.4%,显著高于对照组,小鼠肺脏中的ST2 mRNA水平上升3倍,其配体IL-33水平亦显著上升。将重组IL-33蛋白滴鼻给予未感染流感病毒小鼠,结果表明均可形成明显的气道高反应；应用IL-33单克隆抗体腹腔注射于AHR模型小鼠,感染流感病毒后动物未出现典型AHR症状。结果表明IL-33是流感病毒诱导气道高反应过程的重要因子之一,其单克隆抗体可以作为治疗气道高反应的潜在药物。第二部分研究是在体外药物筛选模型基础上,利用流感小鼠感染模型进行体内筛选。首先,运用蛋白重组技术建立体外抗流感药物筛选模型,将金刚烷胺类药物敏感毒株A/Aichi/2/68(Aichi)M2基因表达质粒转化至大肠杆菌,重组细菌加入IPTG同时加入终浓度70uM的盐酸金刚烷胺,11h后OD600值为0.47,未加入药物处理组的OD600值小于0.2,结果表明成功建立敏感型M2离子通道体外筛选模型。对7种候选抗流感药物以终浓度70uM加入体外筛选模型,结果表明其中3种药物A21、A189和A193具有体外抗流感病毒能力。为了进一步验证候选药物A21、A189和A193体内抗流感效力,用10LD50的流感病毒Aichi株建立体内筛选模型。结果表明,候选药物A193以100mg/kg/d剂量给药可以显著提高小鼠存活率;以50 mg/kg/d和10mg/kg/d剂量给药,可使动物模型存活率分别达到100%和80%。七种候选药物在体内、外均未表现出抵抗耐药性流感病毒的能力。结果表明,候选药物A193是潜在的M2离子通道抑制剂。综上所述,本论文建立了流感病毒诱导小鼠产生气道高反应模型,并运用该模型发现了IL-33是流感病毒诱导产生气道高反应的关键因子,且IL-33单克隆抗体对小鼠哮喘AHR症状具有缓解或治疗效果;建立了流感病毒M2蛋白离子通道融合表达细菌模型,并对候选药物进行了初步筛选;在体外试验基础上,利用小鼠体内药物筛选模型,发现了1种具有潜在抑制金刚烷胺类药物敏感型毒株的药物,为将来进一步研发奠定了基础。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R562.25;R-332


本文编号：2743552