人肺泡上皮对急性肺损伤肺泡内凝血和纤溶调节作用的研究

发布时间：2020-07-16 11:22

【摘要】： 第一部分人肺泡上皮对肺泡内凝血的调节作用 目的蛋白C通路(PC pathway)是体内调节凝血的主要途径。有研究显示，急性肺损伤(ALI)时肺泡内凝血活动增强，且伴有肺泡内的蛋白C通路的显著变化。本课题旨在研究人肺泡上皮细胞能否表达和释放活化蛋白C所需的两个受体一凝血酶调节素(TM)和内皮细胞蛋白C受体(EPCR)。并初步探讨其释放的机制。方法1)采集急性肺损伤(ALI)和静水压性肺水肿(hydrostatic pulmonary edema)患者的肺泡水肿液和血浆，采用ELISA方法测定其中EPCR的含量，并与其中TM含量作相关性分析。2)体外培养人肺泡上皮样A549细胞株和原代分离的人肺泡Ⅱ型上皮细胞并给予不同的病理刺激后测定细胞培养液及细胞裂解液中EPCR和TM蛋白含量的变化以及由此引起的肺泡细胞表面活化蛋白C(APC)生成的变化。3)测定肺泡上皮细胞经佛波醇(PMA)及金属蛋白酶抑制剂等处理后释放EPCR和TM量的变化，探讨可能的释放机制。4)用real-timePCR检测EPCR和TM在肺泡上皮细胞的表达。结果1)ALI患者的肺泡水肿液和血浆中的EPCR含量均高于静水压性肺水肿液，ALI肺泡水肿液中的EPCR含量显著高于血浆中的含量，且其含量高低与疾病的严重程度成正比，结合以往的研究结果，ALI患者肺泡水肿液中的EPCR含量与TM含量成正相关，提示肺泡上皮可能为肺泡内TM和EPCR的肺内来源。2)肺泡上皮细胞能表达活性TM和EPCR，并能在其表面活化蛋白C。炎症因子混合物cytomix(TNF-α，IL-1β，IFN-γ)刺激促进上皮细胞释放EPCR和TM增多，并呈时间和剂量依赖模式，而细胞表面活化蛋白C的活力随EPCR和TM的释放而下降。3)金属蛋白酶抑制剂TAPI-0和GM6001可以抑制上皮细胞释放EPCR和TM，并部分恢复蛋白C的活化功能，提示EPCR和TM的释放是金属蛋白酶水解介导的。4)LPS和cytomix刺激导致EPCR和TM释放的速度不同，LPS引起的释放速度较快，可以被TIMP-3抑制，而不能被TIMP-1，2抑制，提示肿瘤坏死因子—α转化酶(TACE／ADAM-17)介导了快速释放过程，而Cytomix引起的释放速度较慢，均不能被TIMP-1、2、3抑制，提示不同金属蛋白酶参与其中。5)肺泡上皮细胞表达TM和EPCR mRNA，但cytomix刺激不改变基因表达水平。结论我们的实验首次采用原代人肺泡上皮细胞证实了蛋白C通路在人肺泡上皮存在。肺泡上皮细胞在受到外界病理刺激后能通过释放EPCR和TM从而改变肺泡上皮表面APC的含量，而影响肺泡内肺泡内凝血和炎症过程。初步研究发现EPCR和TM的释放与细胞内的金属蛋白酶水解过程有关，LPS介导的EPCR和TM释放是由TACE／ADAM-17介导的，而cytomix引起的EPCR和TM释放可能是由其他基质蛋白酶介导的。我们发现的肺泡上皮细胞能调节肺泡内凝血的功能将为ALI的发病和治疗提供新的思路和策略。 第二部分人肺上皮细胞通过纤溶酶原激活抑制物(PAI-1)调节肺泡内的纤溶状态 目的目前认为ALI时肺泡内纤溶活性降低主要是由于肺泡内增高的PAI-1所致，PAI-1是体内主要的纤溶抑制物，本研究旨在探讨人肺泡上皮是否能表达并释放PAI-1并通过其调节肺泡内纤溶状态。方法1)体外培养A549和人肺泡Ⅱ型上皮细胞，进行细胞表面PAI活性测定来测定肺泡上皮细胞的纤溶活性。2)用ELISA法测定cytomix刺激A549及人肺泡Ⅱ型上皮细胞后肺泡培养液和细胞裂解液中的PAI-1蛋白含量的变化。3)采用Northern Blot法测定肺泡上皮细胞内PAI-1mRNA的表达。结果1)炎症因子刺激使肺泡上皮细胞表面的纤溶活性显著降低，同时伴随着PAI-1释放增加，细胞裂解液中的PAI—1蛋白含量亦增加。2)炎症因子刺激可上调PAI-1 mRNA在肺泡上皮中的表达。结论本实验首次采用原代人肺泡Ⅱ型上皮细胞证实其和A549细胞一样能表达和释放PAI-1，炎症刺激能上调肺泡细胞PAI—1的表达，引起PAI—1释放增多，从而降低肺泡表面的纤溶活性，显示肺泡上皮细胞能通过PAI—1从而实现对肺泡内纤溶的调节。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R563
【图文】：

泡上皮对急性肺损伤肺泡内凝血和纤溶调节作用的研究第一部我们测定随cytomix作用浓度和时间的改变，蛋白c活化及EPCR、TM变化。结果显示Zong/mlcytomix刺激A549细胞后蛋白c活化功能随刺的延长有下降的趋势，18h时与实验开始时有显著差异(p<0.05)，并呈持(图2)。而随着cytomix刺激时间的延长，细胞培养液中的EPcR和TM却呈持续上升趋势(图3)。

时间的延长有下降的趋势，18h时与实验开始时有显著差异(p<0.05)，并呈下降(图2)。而随着cytomix刺激时间的延长，细胞培养液中的EPcR和T水平却呈持续上升趋势(图3)。森森大大大大大大大大一一秘秘秘公刃刃刃刃刃刃刃刃汤汤二份份份毕橄22222金金礴礴礴礴卜飞、.....气镌断!!!备备备备一惰飞飞飞铸、、03612Tlme(hours)图2A549细胞的蛋白C活化功能随cytomix刺激时间延长而下降。*p<o.05vs.oh。

人肺泡上皮对急性肺损伤肺泡内凝血和纤溶调节作用的研究由于A549细胞的蛋白C活化功能在cytomix刺激18h后出现我们选择此时IbJ点测定不同剂量的eytomix(l，3，10，20，song/m白C活化功能和TM、EPCR释放的影响。结果显示A549细胞的蛋能随cytomix剂量的增加而降低(图4)，相反的，细胞培养液中的含量却呈持续上升趋势(图5)。

【共引文献】

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本文编号：2757940