肺结核患者血清小分子标志蛋白分离鉴定的初步研究

发布时间：2020-07-16 21:47

【摘要】： 结核病(tuberculosis,TB)是结核分枝杆菌所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。全球有1/3的人感染过结核(MTB),每年有800万新感染患者和300万患者死亡,表明TB仍是影响全球人类健康的一个严重传染病。然而目前结核的诊断技术不够理想,寻找快速、简便、灵敏度和特异度高的结核杆菌的检测方法,对结核病的预防和控制有着重大的意义。表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)是近些年来建立的筛选血清标志蛋白的蛋白质组学研究方法,具有高通量及高灵敏度,目前已用于多种肿瘤标志物检测的研究。本研究前期工作已经从肺结核患者和正常人血清中筛选出6个最具有诊断意义的肺结核血清标志蛋白。利用这6个标志蛋白建立诊断模型,区分TB与正常对照的分类准确率98.33%,灵敏度96.67%,特异度100%,阳性预测值100%,阴性预测值96.77。但由于SELDI技术尚不能直接鉴定出标志蛋白的序列,只能得出其分子量信息。因此,本研究目的是应用各种技术分离鉴定这些肺结核血清标志蛋白。目的: 1、通过改进样品处理、电泳条件、染色方法等,提高小分子蛋白(10kD)在一维SDS-PAGE上的分辨率,以达到质谱鉴定的要求。 2、应用1D-SDS-PAGE电泳、切胶酶解和高效液相色谱串联质谱等技术方法进一步分离、鉴定前期SELDI已筛选出来具有诊断价值的结核标志蛋白,并进行生物信息学分析。方法: 1、分别应用等电点沉淀法、乙腈沉淀法、Albumin/IgG Removal试剂盒去除血清中的中高丰度蛋白,再分别进行电泳、蛋白浓度测定,观察白蛋白的去除情况和目的蛋白的保留情况。 2、分别比较SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE、4%-12% Bis-tris NuPAGE三种一维凝胶电泳(1D-PAGE)体系对处理过的血清样品中小分子蛋白的分离效果,以及分离胶加入尿素、甘油,电压,染色方法等电泳条件的优化。 3、通过一维凝胶电泳发现、分离肺结核相关血清小分子标志蛋白,经切胶酶解和高效液相色谱串联质谱鉴定目标蛋白,并进行生物信息学分析。结果: 1、三种方法比较,乙腈沉淀法能在去除血清95%左右的高中丰度蛋白的同时收获更多的15kD以下的小分子量蛋白;等电点沉淀法和Albumin/IgG Removal试剂盒法都能去除血清大部分高丰度蛋白,使部分小分子蛋白得以显现,后者能很特异地只去除占血清中蛋白总量75%以上的白蛋白和免疫球蛋白。 2. Tricine-SDS-PAGE能很好地分离血清中的小分子蛋白,20kD以下的蛋白条带清晰可见;分离胶中加入甘油或尿素能改善小分子蛋白的分离效果;银染的灵敏度远高于胶体考染和常规考染,但在本实验中并没有发现新的条带。 3、应用Tricine-SDS-PAGE电泳、切胶酶解和高效液相色谱串联质谱等技术鉴定出分子量为8778Da结核标志蛋白很可能为Apolipoprotein A-II,序列覆盖率为21%,有3个不重复的肽段得到鉴定,结果较为可靠。 4、生物信息学分析发现,载脂蛋白AⅡ是一个分泌蛋白,它的一条氨基酸链含有77个(或76个)氨基酸, MW=8707.9Da(或MW=8579.78),pI=5.05,可能与目的蛋白8778 Da的氨基酸序列相同。结核病的发生、发展与脂质代谢方式密切相关, ApoA-II又与脂质代谢密不可分,ApoA-II可能为结核比较特异的标志物。结论: 1、乙腈沉淀法能在去除血清绝大部分高中丰度蛋白的同时收获更多的15kD以下的小分子量蛋白,适合于分离血清15kD以下的蛋白。 2、Tricine-SDS-PAGE在分离20kD以下的小分子蛋白具有优势,应用常规考染简便,且与质谱兼容较好。 3、质谱鉴定和生物信息学分析结果显示,通过单向SDS-PAGE电泳分离出蛋白,切胶回收、酶解,最后用高效液相串联质谱鉴定目的蛋白这一套技术路线可用于血清小分子低丰度蛋白的分离鉴定。 4、Apo A-II很可能是肺结核相关的血清标志物。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R521
【图文】：

缓冲液,醋酸钠,血清,电泳分离

图 1-2 不同 pH 醋酸钠缓冲液处理血清后上清中蛋白含量ne-SDS-PAGE 电泳分离检测上清(图 1-3) 如图所示，p)缓冲液处理的样品在的 66KD 处染色深且呈成堆状，分白（MW=66KD）去除效果不好。pH 5.6(E)缓冲液处理的色最浅，且 20KD 以下小分子蛋白条带较清晰，表明 pH淀的最佳 pH。

电泳图,血清蛋白含量,试剂盒,正常人

质标准品；A：正常人 2 倍体积 ACN +0.1%TFA；B：正常上样量均为 20μl图 1-8 2 倍 ACN±0.1%TFA 沉淀后血清上清液电泳图ct Albumin/IgG Removal 试剂盒ract 试剂盒去除正常人、结核病人血清样品含量分别为 0.636mg，0.705mg , 而正常人含量分别为 65.7mg，71.1mg，因此它能去除

尿素,分离效果,分离胶,硝酸银

0.25g 硝酸银50μl 甲醛用双蒸水加至 250ml3.65g EDTA-Na2·2H2O用双蒸水加至 250ml 用双蒸水漂洗三次 525ml 甘油用双蒸水加至 250ml结果AGE 胶与尿素 SDS-PAGE 胶的比较间胶 10%，分离胶 18%)，样品跑到分离胶时开始过始弥散成很宽的条带，如图 2-1（I）所示。而尿素%，分离胶 15%）情况明显改善，如图 2-1（II）所

【相似文献】