坎格雷洛缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用机制研究

发布时间：2020-07-19 03:38

【摘要】：目的肺纤维化是一种进展性的,难以治愈的肺部疾病,以肺部炎症、成纤维细胞增殖、胶原纤维沉积为特征,并伴有肺部组织结构破坏,严重影响患者的呼吸功能及生存质量。因此寻找肺纤维化的治疗方法是临床上一项复杂而艰巨的任务。在肺纤维化的病理过程中,由巨噬细胞介导的肺部炎症促进了肺纤维化的进展。据相关文献报道,在中枢小胶质细胞和巨噬细胞中均有表达的G蛋白偶联受体17(G protein-coupled receptor 17,GPR17)可介导脑缺血慢性期炎症和肺部过敏性炎症;另一方面,血小板可对组织损伤或感染做出响应,与中性粒细胞结合,并促使其趋化至组织损伤部位,进一步增强炎症水平。目前临床使用的一种血小板活性抑制剂--坎格雷洛(cangrelor)同时可作为GPR17的非选择性拮抗剂发挥作用。因此在本次研究中,我们对坎格雷洛在博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠肺部炎症及肺纤维化过程中的作用及机制进行探究。方法第一部分我们通过CCK-8实验测试不同剂量的博来霉素及坎格雷洛对RAW264.7细胞生存率的影响,以确定细胞实验的最佳给药剂量;之后通过GPR17 siRNA敲降细胞中的GPR17,探究GPR17是否参与博来霉素诱导的细胞炎症过程;对博来霉素刺激后的RAW264.7细胞给予不同剂量的坎格雷洛(0-2μg/ml),观察坎格雷洛是否能够缓解博来霉素诱导的巨噬细胞炎症。使用不同剂量的坎格雷洛(2.5 mg/kg-10 mg/kg)对博来霉素诱导肺纤维化的小鼠进行背部皮下给药,通过HE染色和Masson染色,观察小鼠肺部炎症和肺部胶原沉积情况;对小鼠肺部进行免疫组化染色和免疫荧光染色,统计肺部表达GPR17的CD68阳性巨噬细胞数量,以确定GPR17在小鼠肺纤维化过程中表达于肺部巨噬细胞;通过Western blot和qRT-PCR检测小鼠肺部炎症因子(TNF-α,IL-6和TGF-β1)及GPR17的表达水平,验证坎格雷洛通过抑制巨噬细胞表达的GPR17而缓解小鼠肺纤维化的设想。第二部分通过流式细胞术,检测肺纤维化小鼠外周血和肺泡灌洗液(BALF)的中性粒细胞与血小板的数量、活化程度及相互结合情况;通过elisa检测肺纤维化小鼠血清和肺泡灌洗液中的相关炎症因子(PF4,CD40L和MPO)分泌情况,探究血小板和中性粒细胞分泌炎症因子的水平是否可被坎格雷洛下调;通过肺部免疫组化染色和Western blot,检测小鼠肺部血小板和中性粒细胞的结合情况,以及中性粒细胞表达CD40蛋白的水平,验证坎格雷洛通过抑制血小板-中性粒细胞结合情况而缓解小鼠肺纤维化的设想。结果第一部分1.通过CCK-8实验确认,博来霉素(1μg/ml)和坎格雷洛(10 μM)给药对RAW 264.7细胞的生存率影响较小(P0.05)。2.通过GPR17 siRNA敲降RAW264.7细胞表达的GPR17后,对细胞进行博来霉素处理,细胞分泌的相关炎症因子水平较低,说明GPR17介导博来霉素诱导的巨噬细胞炎症。3.对博来霉素刺激后的RAW264.7细胞给予不同剂量的坎格雷洛(0-2μg/ml),细胞分泌的相关炎症因子水平(TNF-α,IL-6,TGF-β1)相比于博来霉素处理组显著下调。4.对小鼠肺部进行HE染色和Masson染色,发现使用不同剂量(2.5 mg/kg-10 mg/kg)的坎格雷洛对肺纤维化小鼠给药,小鼠肺部炎症,组织破坏情况和肺部胶原沉积情况显著减轻,肺部纤维化评分下降(6.17±0.98 for BLM vs 4.33±0.82 for BLM+Cang 2.5 mg/kg;4±0.63 for BLM+Cang 5 mg/kg;2.67±0.82 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001),呈药物浓度依赖性。5.对小鼠肺部进行免疫组化染色和免疫荧光染色,发现坎格雷洛给药后,小鼠肺部 GPR17阳性细胞数量(65.83±6.62 for BLM vs 32.17±3.87 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)和 CD68 阳性巨噬细胞数量(66.67±7.23 for BLM vs 36.17±5.98 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)均显著下降,同时 GPR17 阳性细胞和CD68阳性巨噬细胞在免疫荧光染色中出现共定位。6.通过qRT-PCR和Westem blot,发现肺纤维化小鼠产生的相关炎症因子(TNF-α,IL-6,TGF-β1)转录水平及分泌水平在坎格雷洛给药后均显著下降。第二部分1.取肺纤维化小鼠的外周血和肺泡灌洗液(BALF)进行流式分选,发现外周血中的中性粒细胞数量与血小板数量在坎格雷洛处理后均显著下降;血小板活化程度(CD62P+/CD41+比值)(0.74±0.13 for BLM vs 0.57±0.09 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.05)以及血小板-中性粒细胞结合比例(CD41/Ly-6G双阳性细胞数量)(7.27±0.72 for BLM vs 3.64±1.86 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.01)均降低。肺泡灌洗液结果趋势相近。2.通过elisa检测肺纤维化小鼠的外周血和肺泡灌洗液(BALF)发现,由中性粒细胞和血小板产生的相关炎症因子(PF4,CD40L,MPO)分泌水平在坎格雷洛给药后均显著下调。3.通过肺部免疫组化染色和Western blot,观察到肺纤维化小鼠的中性粒细胞与CD40的共定位(MPO/CD40比值)在坎格雷洛给药后无明显变化(P0.05),而 CD40 阳性细胞数量(301.3 ± 9.33 for BLM vs 225.0 ± 9.94 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)和 MPO阳性细胞数量(252.9±18.45 for BLM vs 147.4±11.01 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)显著减少;同时 CD40 蛋白表达水平下调(189.4±47.21 for BLM vs 159.1±31.29 for BLM+Cang 10 mg/kg,P0.001)。结论坎格雷洛作为GPR17的非选择性拮抗剂,在RAW264.7巨噬细胞系中下调博来霉素诱导的巨噬细胞炎症水平,在小鼠肺纤维化模型中抑制GPR17阳性巨噬细胞数量上调;另一方面,坎格雷洛可作为血小板活性抑制剂发挥作用,通过减少血小板-中性粒细胞结合,抑制CD40-CD40L通路介导的中性粒细胞活化聚集,下调肺部炎症水平。综上所述,我们推测坎格雷洛可通过拮抗GPR17介导的巨噬细胞炎症,以及抑制血小板与中性粒细胞的活化和趋化作用,缓解博来霉素诱导的小鼠肺部炎症及肺纤维化。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563
【图文】：

中起作用逡逑我们用不同剂量的博来霉素（0－２ｐｇ／ｍｌ）对小鼠ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞进行处逡逑理，通过ＣＣＫ－８试剂盒检测小鼠ＲＡＷ邋２６４．７巨噬细胞的生存率（图２．１），可以逡逑观察到剂量为２［ｉｇ／ｍｌ的博来霉素处理细胞对其生存率影响较大（１００％士邋１３．２％邋ｆｏｒ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｖｓ邋７０．８％邋土邋１４．６％邋ｆｏｒ邋２邋｜ｉｇ／ｍＬ邋ＢＬＭ，邋Ｐ邋＜邋０．０１），因此我们选取剂量为邋１邋ｐｇ／ｍｌ逡逑的博来霉素作为常规细胞给药剂量。接下来我们用ＧＰＲ１７ｓｉＲＮＡ处理细胞，以抑逡逑制胞内ＧＰＲ１７表达，提取巨噬细胞的ｍＲＮＡ，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ＧＰＲ１７在胞内逡逑的转录水平（图２．２），发现剂量为１邋ｐｇ／ｍｌ的博来霉素处理巨噬细胞后，ＧＰＲ１７逡逑转录水平显著上升；用ＧＰＲ１７ｓｉＲＮＡ单独处理细胞后，细胞内ＧＰＲ１７ｍＲＮＡ转逡逑录水平降低，用ＧＰＲ１７ｓｉＲＮＡ和博来霉素先后处理细胞，ＧＰＲ１７的转录水平仍保逡逑持较低水平。我们继续通过Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＧＰＲ１７在胞内的蛋白表达量（图２．２），逡逑由图可知ＧＰＲ１７蛋白表达量与ｍＲＮＡ转录结果趋势相近。以上结果提示ＧＰＲ１７逡逑可能在博来霉素诱导的巨噬细胞炎症过程中起作用。逡逑１２０ｎ逡逑＾１00．Ｘ邋＾邋Ｔ邋Ｘ逡逑＿ｌｌｉｉ逡逑０逦０．１逦０．２５逦０．５逦１逦２

a桑校煎澹埃�００１）逡逑下一步，我们通过ｑＲＴ－ＰＣＲ和ｅｌｉｓａ检测小鼠ＲＡＷ邋２６４．７巨噬细胞炎症因子逡逑（ＴＮＦ－ｃｔ，ＩＬ－６，邋ＴＧＦ－Ｊ３）的转录水平（图２．３）和蛋白表达水平（图２．４）。根据逡逑实验结果，博来霉素处理巨噬细胞后，上述炎症因子的转录和表达水平均显著上逡逑升；ＧＰＲ１７邋ｓｉＲＮＡ单独处理细胞后，炎症因子转录水平和蛋白表徶量均低于对照逡逑组；而使用ＧＰＲ１７ｓｉＲＮＡ和博来霉素先后处理细胞，炎症因子水平显著低于博来逡逑霉素单独给药组。实验结果提示我们，ＧＰＲ１７在博来霉素诱导的巨噬细胞炎症过逡逑程中起关键作用，而通过ＧＰＲ１７ｓｉＲＮＡ敲降胞内ＧＰＲ１７，会导致巨噬细胞受博来逡逑霉素刺激产生的炎症水平显著降低。逡逑１８逡�

本文编号：2761851