AP-2α在烟雾暴露所致的血管内皮细胞凋亡中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-25 14:42

【摘要】： 研究背景:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是严重影响人类健康的常见多发病,患病人数多,死亡率高,社会经济负担重,是全球性公共卫生问题。该病发病机制未完全明了,且无理想的治疗方法。烟雾暴露是COPD的重要致病因素。除慢性气道和肺部炎症、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及氧化/抗氧化失衡等学说外,肺间隔细胞凋亡在COPD发生发展中的作用日益受到重视,且与上述学说有千丝万缕的联系。肺间隔细胞凋亡的累积效应将导致肺气肿的发生和呼吸功能的降低,导致呼吸衰竭的发生。因此,干预肺间隔细胞凋亡是目前COPD防治研究中的一项重要课题。转录因子活化蛋白-2(transcription factoractivator protein-2,AP-2)家族是一组发育调节,维甲酸诱导的基因DNA结合蛋白,AP-2α(transcription factor activator protein-2α,AP-2α)是最早被鉴定和研究的AP-2家族成员,参与了许多基因的表达如VEGF、P~(53)、p~(21WAF/CIP)、Bcl-2、锰过氧化物岐化酶(Manganese superoxidedismutase,MnSOD)等;参与了脊椎动物细胞黏附、生长、凋亡、组织分化、胚胎发育、肿瘤发生等病理生理过程。其中大部分研究集中在AP-2α对增殖凋亡的调控上。依据细胞类型及实验条件的不同,AP-2α分别发挥促凋亡或促增殖的作用。但是,在烟雾暴露所致的COPD大鼠肺组织及香烟提取物(CSE)刺激的人脐静脉内皮细胞株ECV304中AP-2α是否表达,是否对烟雾暴露引起的细胞凋亡及Caspase-3的活化有影响,其机制是否与其激活结构域有关等等,尚无相关报道。目的:研究熏烟所致COPD大鼠肺组织中肺间隔细胞的凋亡情况及AP-2α的表达水平;进一步通过细胞实验研究AP-2α对CSE诱导的ECV304凋亡的影响及机制。方法:采用被动吸烟80天的方法复制大鼠COPD模型,采用TUNEL法检测肺组织细胞凋亡、Western blot法检测肺组织中活化的Caspase-3、免疫组织化学及Western blot法检测胞核中AP-2α蛋白的表达;通过MTT、Hoechst染核、Western blot等方法研究CSE对ECV304增殖、凋亡、Caspase-3和AP-2α表达的影响;通过腺病毒介导的转染、Hoechst染核、Western blot等方法研究过表达AP-2α对CSE诱导的ECV304凋亡、Caspase-3活化的影响。采用质粒介导的转染、Hoechst染核、Western blot等方法研究过表达AP-2α的突变体AP-2Δ(只具有结合结构域,而没有转录激活结构域)对CSE诱导的ECV304凋亡、Caspase-3活化的影响。数据以均数±标准差(x±s)表示,用Bartlett法进行方差齐性检验,两组间比较用t检验,多组间比较用单因素方差分析,多个样本均数的多重比较用LSD-t检验。多个样本率的比较用X~2检验。结果:研究发现,烟雾暴露80天成功复制了COPD大鼠模型,表现为炎症细胞浸润,肺泡腔扩大,FEV_(0.3)/FVC降低,肺间隔细胞凋亡增多,Caspase-3活化增加;同时AP-2α蛋白表达增加。在CSE刺激的ECV304细胞中,细胞凋亡增多,AP-2α表达增加;AP-2α的过表达可抑制CSE诱导的ECV304细胞凋亡,表现为细胞凋亡率降低和Caspase-3的活性片段(17KD)减少。AP-2Δ瞬时转染ECV304细胞并使其过表达后对基础及CSE诱导的细胞凋亡、Caspase-3的活化没有明显影响。结论:AP-2α在烟雾暴露法复制的COPD大鼠肺组织及CSE刺激的ECV304细胞中表达增加。在CSE刺激的ECV304细胞中,AP-2α抑制CSE诱导的Caspase-3的活化及细胞凋亡,其作用需要其激活结构域存在。AP-2α可能参与了COPD的发生发展。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R563.9
【图文】：

正常对双组大民的肺组尔(BBx100)

正常对照组肺池间隔细胞洲亡(光碗x400)

熏烟,对照组,活化的

通过 BandLeader软件进行蛋白条带灰度定量分析(用灰度值表示，该值越高，含量越高)。与对照组相比，COPD组大鼠肺组织中活化的CasPase一3表达增加，差异有统计学意义(尽0.001)。见图3，表4。正常对照组COPO组CasPase一317KDB一aetin42KD图3:熏烟组和对照组大鼠肺组织胞浆蛋白中Caspase一3的表达。(p一actin作为胞浆蛋白的内对照)表 4COPD组与对照组大鼠肺组织胞浆蛋白中活化的Caspase一3(17xD)的比较(x士s)组别例数对照组 ActiveCasPase一3/日一aetin 0.9199士0.0011COPD组 2.3524士0.0042注，与对照组相比，P<0.001(卜114.2，卜21)。

【参考文献】