【摘要】：支气管哮喘是目前严重威胁人类公共健康最常见的慢性肺部疾病之一,主要以反复发作性的气急、胸闷、咳嗽等为主要临床症状,常在夜间和(或)清晨发作,如果长期反复发作则可致气道重塑导致气道增厚与狭窄,最终成为阻塞性肺气肿。目前尚未完全明确哮喘的具体发病机制,有研究表明支气管上皮细胞的脱落和损伤参与了哮喘的病理过程,支气管上皮细胞的凋亡为哮喘发病的起始环节。穿孔素(PFP)和颗粒酶B(GzmB)主要由细胞毒性T细胞(CTL细胞)和自然杀伤细胞(NK细胞)分泌,是介导细胞凋亡的重要因子,其在哮喘大鼠肺组织中的表达高低以及其对支气管上皮细胞凋亡的诱导作用目前尚不明确。重组人生长激素(rhGH)为人工合成的一种多肽,其能够通过复杂的机制抑制相应细胞的凋亡从而达到治疗目的。本实验通过建立大鼠哮喘模型并应用rhGH进行干预,观察PFP与GzmB的在肺组织中的表达情况、上皮细胞凋亡变化及其相互关系,以期为临床治疗哮喘提供相应的理论依据。 目的 本实验通过建立哮喘大鼠模型,探讨哮喘大鼠支气管上皮细胞凋亡情况、肺组织中PFP、GzmB的表达情况及rhGH的干预作用。 材料和方法 1实验动物分组和哮喘模型制作 选取健康雄性4-6周龄SD大鼠30只,遵照随机原则分为正常对照组、哮喘模型组和rhGH干预组,每组各10只。第1,8,15天哮喘组和干预组大鼠分别应用新鲜调配的10%卵清蛋白-氢氧化铝混悬液1ml(其中卵清蛋白100mg,氢氧化铝100mg)腹腔注射,致敏3次,对照组大鼠应用生理盐水1ml进行腹腔注射。第16d开始,分别应用1%卵清蛋白-氢氧化铝混悬液5ml给哮喘组和干预组大鼠雾化吸入30分钟,隔日进行1次共雾化20次；干预组各大鼠在第11次雾化吸入混悬液前30分钟给予皮下注射rhGH(1.33KU/Kg),共注射10次；对照组大鼠每次雾化吸入生理盐水5ml 30分钟,隔日1次,共进行20次。 2肺组织标本制备 最后一次雾化吸入后各组大鼠分别腹腔注射苯巴比妥100mg处死,迅速解剖取右肺置于冷冻管中并放入液氮灌中冻存,做RT-PCR用。应用无菌生理盐水和4%甲醛溶液对左肺进行灌注和冲洗,甲醛固定后行石蜡包埋。分别于取垂直和平行气道两个方向取材切片,作HE染色及TUNEL原位细胞凋亡检测。 3原位细胞凋亡结果分析 于光镜下分析结果：随机选取5个高倍镜野(×400并且含有同等级别支气管)的支气管上皮总数及阳性染色上皮细胞数(着色为棕黄色),按照公式：阳性细胞数/细胞总数×100%以计算上皮细胞凋亡指数。 4 RT-PCR分析 将冻存的肺组织采用Trizol法提取总RNA,逆转录为cDNA后应用事先设计好的引物扩增目的片段PFP、GzmB与GAPDH.进行琼脂糖凝胶电泳后,用Band Scan 5.0凝胶分析软件分别测定PFP、GzmB与GAPDH的灰度值,并分别以与两者的比值作为该大鼠的代表值。 5统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件包对所得数据进行统计学分析,实验数据以x±s表示,多个样本均数间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验；相关分析采用pearson相关行检验；以a=0.05为检验水准。 结果 1病理学改变 正常对照组肺组织形态学无异常改变。哮喘模型组大鼠肺组织HE染色后可见支气管管腔中有大小不一的粘液栓形成,支气管上皮细胞水肿、脱落、结构不规则；杯状细胞增多,黏膜下层及平滑肌增厚；气道壁及肺间质有大量的炎性细胞浸润,以嗜酸性粒细胞及淋巴细胞为主；rhGH干预组炎症反应较哮喘组轻,杯状细胞减少,黏膜下层及平滑肌增厚较哮喘组减轻。2上皮细胞凋亡的变化 正常对照组支气管上皮凋亡(TUNEL原位细胞凋亡染色为棕黄色)较少；哮喘组支气管上皮有较多凋亡,高于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05)；应用rhGH干预后支气管上皮细胞凋亡高于正常对照组,但明显低于哮喘组,差异有统计学意义(P0.05)。 3 RT-PCR结果 哮喘组和干预组的PFP及GzmB表达量均较正常对照组增加,差异具有统计学意义(P0.05), rhGH干预组的两者的表达量均较哮喘组减少,差异具有统计学意义(P0.05)。 4相关性分析 哮喘大鼠肺组织中PFP表达量与支气管上皮细胞凋亡指数呈正相关(r=0.800, P 0.05), GzmB表达量与支气管上皮凋亡指数亦呈正相关(r=0.806,P0.05)。 结论 (1)PFP及GzmB通过促进支气管上皮细胞的凋亡参与了支气管哮喘的发生及发展过程。 (2) rhGH可通过减少PFP及GzmB的表达以缓解气道炎症及气道重塑。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R562.25
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本文编号：2774945
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