AcSDKP对TGF-β1介导的P38通路调节在大鼠肺成纤维细胞胶原合成中的作用

发布时间：2020-08-22 01:42

【摘要】：矽肺(silicosis)亦曾称为硅肺,是由于长期吸入大量游离二氧化硅(SiO2)粉尘所引起,以肺部广泛纤维化为主的职业性疾病。其病变特征性改变为肺内矽结节形成和弥漫性间质纤维化。尽管多年来人们对矽肺的发病机制与防治研究做了大量的工作,但至今为止有关矽肺确切的发病机制仍不是十分清楚。特别是如何防治矽肺纤维化的形成与进展,一直是矽肺病研究的难点。因此,对矽肺病发病机制与防治研究也一直是职业病研究领域的重点和热点课题。近年来研究显示诸多细胞因子在矽肺的发生发展过程中起着重要的作用,它们构成了一个复杂的信号转导的分子网络系统。其中对转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)研究的较为深入。TGF-β是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子,能够调节细胞的生长、增殖、分化和免疫功能等。TGF-β是一较强的致纤维化细胞因子,与其细胞膜型的受体,包括Ⅰ型受体(transforming growth factor-βtypeⅠreceptor,TGF-βRⅠ)和Ⅱ型受体(transforming growth factor-βtypeⅡreceptor,TGF-βRⅡ)均参与了肺纤维化发生发展过程中的信号传递过程。大多数资料表明,TGF-β与其膜型受体结合后才能介导细胞的信号由细胞外向细胞内的传递,而膜型受体活性与表达的数量也直接影响着TGF-β的生物学功能与作用。 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要包括四类:细胞外调节激酶(extracellular signal-regulated,ERK)、P38MAPK激酶(P38 mitogn-activated protein kinase,P38MAPK)、c-jun氨基末端激酶/应激激活蛋白激酶(c-jun amino-terminal kinase/stress-activated protein kinase,JNK/ SAPK)、ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1(big MAP kinase l,BMK1)。MAPK级联是一个庞大、复杂而又精细的网络,它参与胞外信号从细胞外转导到细胞内的过程,是细胞内信号传递的主要通路之一,调节着一系列复杂的生物学功能。近期研究发现,TGF-β介导的P38丝裂原活化蛋白酶(P38 MAPK)信号转导通路与肺纤维化的形成密切相关。 N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,AcSDKP)最早是由Frindel等人于1977年从胎牛骨髓中提取的一种四肽,起初研究发现它是一种生理性造血系统的生长抑制因子,对造血功能具有一定的调节作用。随着研究的深入,人们发现AcSDKP还能够抑制心脏、肾脏等一些器官内的成纤维细胞的增殖和胶原的沉积,具有较为广泛的抗器官纤维化的作用。在我们前期的实验中也已经证实,AcSDKP能够抑制矽肺大鼠肺内胶原的沉积,提示AcSDKP具有抗矽肺纤维化的作用。然而,其拮抗矽肺纤维化作用机制并不是十分清楚。 本实验旨在观察AcSDKP通过对TGF-β1介导的P38 MAPK信号转导途径的调节在肺成纤维细胞增殖与胶原合成中的影响,进而研究与探索AcSDKP在防治矽肺纤维化方面的作用与可能的机制。 目的: 1研究与探讨TGF-β1及其受体介导的P38 MAPK信号转导途径在肺成纤维细胞增殖与胶原表达方面的作用。 2研究与探讨AcSDKP能否通过对TGF-β1/TGF-β受体/P38 MAPK/c-myc信号转导途径的调节发挥其抑制肺成纤维细胞增殖与胶原表达的作用。 3为阐明AcSDKP抗矽肺纤维化的作用机制提供一定的理论及实验依据。 方法: 1新生Wistar大鼠肺成纤维细胞的原代培养、传代。第四代细胞用于实验研究。 2实验分组:①对照组(control):为0.4%血清浓度的DMEM培养液;②TGF-β1刺激组(TGF-β1):0.4%血清浓度的DMEM培养液中,加入终浓度为5 ng/ml TGF-β1孵育细胞45 min;③TGF-β受体阻滞剂(LY364947)干预组(LY364947):为0.4%血清浓度的DMEM培养液中,加入终浓度为59 nmol/L的LY364947预孵育3 h,再加入终浓度为5 ng/ml TGF-β1共同孵育细胞45 min;④P38 MAPK特异性抑制剂(SB203580)干预组(SB203580):为0.4%血清浓度的DMEM培养液中,加入终浓度为10 nmol/L的SB203580预孵育45 min后,再给予加入5 ng/ml TGF-β1共同孵育细胞45 min;⑤AcSDKP干预组(AcSDKP):为0.4%血清浓度的DMEM培养液中,加入终浓度为10-8 mol/L AcSDKP预孵育45 min后,再加入终浓度为5 ng/ml TGF-β1共同孵育细胞45 min。 3采用MTT法检测大鼠肺成纤维细胞的增殖情况。 4采用Western blot法检测大鼠肺成纤维细胞TGF-βⅠ型受体、TGF-βⅡ型受体、P38 MAPK、phospho-P38 MAPK、c-myc和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达情况。 5采用免疫细胞化学法和激光扫描共聚焦显微镜检测大鼠肺成纤维细胞phospho-P38 MAPK蛋白的表达情况。 6采用Real-time PCR法检测大鼠肺成纤维细胞TGF-βⅠ型受体、TGF-βⅡ型受体mRNA的表达情况。 7采用单因素方差分析进行组间均数的比较,以P0.05表示差异有统计学意义。 结果: 1 MTT法检测结果显示:与对照组比较,TGF-β1能够促进大鼠肺成纤维细胞的增殖,而分别给予LY364947、SB203580和AcSDKP干预后,细胞增殖均受到抑制,差异具有统计学意义(P0.05)。 2 Real-time PCR结果显示:与对照组比较,经TGF-β1刺激后,细胞的TGF-βⅠ型受体、TGF-βⅡ型受体mRNA的表达明显增高,当给予LY364947和AcSDKP干预后,细胞中TGF-βⅠ型受体、TGF-βⅡ型受体mRNA的表达均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。而SB203580对细胞TGF-βⅠ型受体、TGF-βⅡ型受体mRNA的表达无明显的抑制作用。 3 Western blot法检测结果显示:与对照组相比较,TGF-β1刺激组大鼠肺成纤维细胞的TGF-βⅠ型受体、TGF-βⅡ型受体、phospho-P38 MAPK、c-myc蛋白以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达均增强;给予LY364947干预和AcSDKP干预后,大鼠肺成纤维细胞TGF-βⅠ型、TGF-βⅡ型受体、phospho-P38 MAPK、c-myc蛋白以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);给予SB203580干预后,大鼠肺成纤维细胞的phospho-P38 MAPK、c-myc蛋白以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),而对TGF-βⅠ型受体、TGF-βⅡ型受体蛋白的表达无明显改变;各组间P38 MAPK蛋白的表达无明显改变(P0.05)。 4免疫细胞化学染色法检测结果显示:与对照组比较,TGF-β1刺激组中phospho-P38 MAPK蛋白的表达增加,与TGF-β1刺激组比较,TGF-β受体阻滞剂组、P38 MAPK特异性抑制剂组和AcSDKP干预组,phospho-P38 MAPK蛋白的表达均有所下降,差异具有统计学意义(P0.05)。 5激光扫描共聚焦显微镜结果显示:与对照组比较,经TGF-β1刺激后大鼠肺成纤维细胞胞浆中phospho-P38 MAPK荧光强度降低,胞核荧光强度明显增加。而应用LY364947、SB203580和AcSDKP进行干预后,胞浆中phospho-P38 MAPK荧光强度较TGF-β1刺激组强,而胞核中Phospho-P38 MAPK荧光强度均较TGF-β1刺激组明显减弱,差异具有统计学意义(P0.05)。 结论: TGF-β1能够通过其受体介导的P38 MAPK信号转导途径,进而诱导大鼠肺成纤维细胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。AcSDKP能够通过阻断TGF-β1介导的P38 MAPK信号转导途径,从而抑制大鼠肺成纤维细胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。这可能与AcSDKP抗矽肺纤维化的作用相关。
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R563.9
【图文】：

标准曲线GAPDH

TGF-βⅠ和Ⅱ型受体mRNA的表达（Real-timePCR）

图 3 溶解曲线（Real Time-PCR）TGF-β RⅠand GAPDH TGF-β RⅡand GAPDHMaker 1 2 3 4 555KD43KD72KD55KD43KD26KD43KD26KD55KD43KD130KDTGF-β RⅠ(55KD)TGF-β RⅡ(62KD)p-P38(43KD)P38(43KD)C-myc (49KD)Ⅰ型胶原(130 KD)

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本文编号：2800107