【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是危害人类健康的重大疑难疾病,其病理机制复杂又相互影响,其中炎症反应在COPD发病过程中起着重要作用。阻抑炎症反应是减轻症状,提高COPD防治水平,延缓疾病进展的重要手段。COPD的炎症反应涉及多个细胞因子、多种细胞类型以及多条信号通路,从而形成COPD炎症分子网络,对COPD分子网络中关键细胞因子及核心信号通路的研究有助于更好地阐明中医药治疗COPD的作用机制及特点。本文就观察肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导下肺泡Ⅱ型上皮细胞A549分泌炎症因子和信号通路核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)、Janus激酶/信号转导转录激活因子(JAK/STAT)、过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)的激活情况,筛选并优化COPD体外炎症模型,研究调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)对TNF-α诱导下A549细胞对NF-κB信号通路的调控作用,探讨中医药阻抑COPD炎症的分子生物学机制。目的以TNF-α、LPS诱导A549细胞筛选并优化A549细胞体外炎症模型,观察其分泌炎症因子的情况以及对NF-κB、MAPK、JAK-STAT、PPAR信号通路中转录因子NF-κB、核转录因子激活蛋白-1(Nuclear transcription factor activator protein-1,AP-1)、信号转导转录激活因子-3(signal transducer and activator of transciption-3,STAT3)、过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)活性的影响,筛选其靶通路,探讨调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)对A549细胞NF-κB信号通路的调控作用,为揭示调补肺肾三法阻抑COPD炎症反应的分子作用机制提供依据。方法1筛选并优化A549细胞体外炎症模型MTT检测TNF-α不同浓度(5ng/m L、10ng/m L、20ng/m L、40ng/m L)诱导A549细胞不同作用时间(6h、12h、24h、48h、72h)对细胞生长的影响;MTT检测LPS不同浓度(0.25μg/m L、0.5μg/m L、1μg/m L、2μg/m L)不同作用时间(6h、12h、24h、48h、72h)对细胞生长的影响。ELISA检测20ng/m L TNF-α诱导A549细胞24h后上清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、黏蛋白5AC(MUC5AC)等细胞因子的分泌情况;ELISA检测1μg/m L、2μg/m L LPS诱导A549细胞6h、12h、24h、48h后上清中IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-9等细胞因子的分泌情况。凝胶迁移率实验(EMSA)检测10ng/m L、20ng/m L TNF-α诱导A549细胞24h、48h后转录因子NF-κB、AP-1、STAT3、PPAR活化情况;EMSA检测2μg/m L LPS诱导A549细胞24h后转录因子NF-κB、AP-1、STAT3、PPAR活化情况。2含药血清制备普通级日本大耳白兔96只随机分为正常对照组、补肺健脾组、补肺益肾组和益气滋肾组。分别用生理盐水、补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方灌胃,于第7次灌胃后1h腹主动脉采血,离心分离血清,过滤分装,56℃、30min灭活后,-80℃保存所得含药血清。3观察调补肺肾三法对信号通路NF-κB的影响根据以上模型筛选结果,分组干预细胞:分为空白血清组、模型组、补肺益肾组、补肺健脾组、益气滋肾组,每组血清又分为低(10%)、中(20%)、高(40%)三个浓度,取上述相同指标进行测定。之后添加信号通路NF-κB抑制剂二硫氨基甲酸肽吡咯烷(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组,EMSA检测A549中转录因子NF-κB的活性。结果1筛选并优化A549细胞体外炎症模型1.1 TNF-α、LPS对A549细胞生长的影响与正常对照组相比,TNF-α在诱导A549细胞12h后,40ng/m L组OD值降低有显著性差异(p0.01);在诱导24h后,TNF-α10ng/m L、20ng/m L、40ng/m L组OD值降低(p0.05);在诱导48h后,TNF-α20ng/m L组OD值降低(p0.05)。与正常对照组相比,0.25-2μg/m L LPS诱导A549细胞6-72h,细胞OD值的变化无统计学意义(p0.05)。1.2 TNF-α、LPS对A549细胞分泌细胞因子的影响与正常对照组相比,20ng/m L TNF-α组细胞因子MMP-9、MMP-3、TNF-α、IL-8、MUC5AC分泌水平显著升高(p0.05,p0.01);余细胞因子TIMP-1、TIMP-1/MMP-9、IL-10、TIMP-1、IL-4分泌水平升高无统计学意义(p0.05)。与正常对照组相比,2μg/m L LPS诱导A549细胞12h时细胞因子IL-6和IL-8分泌增多(p0.05);1μg/m L、2μg/m L LPS诱导A549细胞6h MMP-9分泌减少(p0.05),2μg/m L LPS诱导A549细胞48h时MMP-9分泌减少(p0.05);1μg/m L LPS诱导A549细胞24h时TNF-α分泌减少(p0.05);1μg/m L、2μg/m L LPS诱导A549细胞6-48h时TIMP-1分泌显著减少(p0.01)。1μg/m L、2μg/m L LPS诱导A549细胞6-48h时炎症因子IL-10、MUC5AC分泌水平变化无统计学意义(p0.05)。1.3 TNF-α、LPS对A549细胞转录因子NF-κB、AP-1、PPAR、STAT3活性的影响与正常对照组相比,10ng/m L、20ng/m L TNF-α组诱导A549细胞24h时转录因子NF-κB活性增强,以20ng/m L组最为显著(p0.01),20ng/m L TNF-α组诱导A549细胞48h时NF-κB活性减弱(p0.01)。与正常对照组相比,10ng/m L、20ng/m L TNF-α组诱导A549细胞24h时转录因子AP-1活性增强,以20ng/m L组最为显著(p0.01)。与正常对照组相比,10ng/m L、20ng/m L TNF-α诱导A549细胞24h、48h时转录因子PPAR、STAT3活性变化无统计学意义(p0.05)。2μg/m L LPS诱导A549细胞24h时AP-1、PPAR、STAT3活性减弱(p0.05),NF-κB活性变化无统计学意义(p0.05)。2调补肺肾三法对TNF-α诱导A549细胞炎症模型的NF-κB信号通路的影响2.1调补肺肾三法不同浓度含药血清对细胞A549生长的影响与正常对照组相比,20%调补肺肾三法血清(补肺益肾组、补肺健脾组、益气滋肾组)OD值明显升高(p0.01,p0.05);与模型组相比,20%调补肺肾三法血清组OD值明显升高(p0.01,p0.05),40%补肺健脾组OD值降低(p0.05),余浓度含药血清OD值变化无明显统计学意义(p0.05)。2.2调补肺肾三法对A549细胞分泌IL-8、MMP-9、TNF-α的影响与20%空白血清组比较,模型组、调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)及PDTC组诱导A549细胞24h时细胞因子IL-8、MMP-9、TNF-α分泌显著增多(p0.01)。与20%模型组比较,益气滋肾组诱导A549细胞24h时IL-8分泌增多(p0.05),补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组MMP-9分泌显著增多(p0.01),补肺益肾组、益气滋肾组TNF-α分泌增多(p0.05,p0.01),补肺健脾组TNF-α分泌减少(p0.05)。与40%空白血清组比较,模型组、调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)及PDTC组诱导A549细胞24h时IL-8分泌增多(p0.01),模型组、补肺益肾组、补肺健脾组MMP-9分泌增多(p0.01),模型组TNF-α分泌增多(p0.01)。与40%模型组比较,调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)诱导A549细胞24h时TNF-α分泌显著减少(p0.01);调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)及PDTC组诱导A549细胞24h时IL-8分泌减少(p0.05);益气滋肾组、PDTC组诱导A549细胞24h时MMP-9分泌减少(p0.05,p0.01),补肺益肾、补肺健脾组MMP-9分泌有减少趋势,但无统计学意义(p0.05)。2.3调补肺肾三法及抑制剂PDTC含药血清对A549细胞NF-κB通路活性的影响与空白血清组相比,40%模型组血清(20ng/m L TNF-α)诱导A549细胞24h时转录因子NF-κB活性增强(p0.05)。与模型组相比,40%调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)及PDTC组诱导A549细胞24h时转录因子NF-κB活性减弱有显著性差异(p0.01)。与空白血清组相比,10%、20%模型组诱导A549细胞24h时转录因子NF-κB活性有增强趋势,但无统计学意义(p0.05),且与模型组相比,10%、20%调补肺肾三方血清组及PDTC组转录因子NF-κB活性减弱无统计学意义(p0.05)。结论1.TNF-α可使A549细胞生长受到抑制,能够诱导细胞分泌IL-8、MMP-9等炎症因子,能够激活NF-κB、MAPK信号通路,可使用TNF-α诱导A549细胞作为A549细胞体外炎症模型。2.确立了优化TNF-α诱导A549细胞的条件,20ng/m L TNF-α诱导A549细胞24h作为细胞炎症模型是适宜的。3.LPS对A549细胞生长影响较小,对细胞分泌IL-6、IL-8、MMP-9等炎症因子及NF-κB、MAPK、JAK-STAT、PPAR通路的活性的影响不显著,LPS诱导A549细胞不适于建立细胞炎症模型。4.调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)均可明显下调TNF-α诱导的A549细胞分泌炎症因子IL-8、MMP-9、TNF-α水平,减弱转录因子NF-κB的活性。调补肺肾三法调控NF-κB信号通路以阻抑炎症反应可能是其治疗COPD的分子机制之一,具体机制有待进一步深入研究。
【学位授予单位】：河南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.9
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本文编号：
2801259
