皮层肌动蛋白结合肽在应力诱导的气道黏液分泌过程中的介导作用

发布时间：2020-08-22 21:22

【摘要】：目的:探讨皮层肌动蛋白结合肽(Cortactin)对剪应力(SS)诱导的气道上皮细胞黏液高分泌的影响,并试图明确该介导作用的关键靶点。方法:1、体外培养法培养人气道上皮细胞16HBE,并将细胞随机分为6组:A:空白对照组;B:SS组;C:SS+野生型Cortactin组;D:SS+pcDNA3-Cortactin ~(421)-MU组;E:SS+pcDNA3-Cortactin ~(466)-MU组;F:SS+pcDNA3-Cortactin ~(482)-MU组;2、分别转染野生型Cortactin及已构建好的Cortactin各型突变体pcDNA3-Cortactin ~(421)-MU、SS+pcDNA3-Cortactin ~(466)-MU、SS+pcDNA3-Cortactin ~(482)-MU。采用蛋白印迹法(Western blot)检测每组细胞Cortactin蛋白的表达水平,用转染组和对照组相比,明确各组细胞载体成功转染后,方可行后续步骤。3、实验的刺激因素为旋转装置产生的剪应力,为确保能成功构建黏液高分泌模型,旋转装置的运行参数为:30转/分,作用时间30min。4、用Western blot观察各组细胞p-Cortactin蛋白表达水平,ELISA测定各组细胞黏蛋白MUC5AC蛋白量,RT-PCR法观测各组裂解细胞MUC5ACmRNA水平。转染Cortactin各定点突变体,比较剪应力作用后各组细胞中不同磷酸化Cortactin蛋白的含量以及各组细胞培养上清液中MUC5AC含量的差别,推断出Cortactin介导MUC5AC分泌的关键作用位点。结果:1、转染野生型Cortactin及已构建好的Cortactin各型突变体后Cortactin蛋白水平较对照组明显升高(p0.01),说明载体已经成功转染细胞。2、与空白对照组相比,在SS刺激下,p-Cortactin水平、MUC5AC mRNA转录水平、MUC5AC蛋白分泌量显著增加(均为p0.01)。3、与单纯SS刺激组相比,SS+野生型Cortactin组细胞的p-Cortactin蛋白、粘蛋白MUC5AC表达亦显著增加(分别为p0.01,p0.05)。4、与SS+野生型Cortactin组相比,SS+pcDNA3-Cortactin ~(466)-MU组的p-Cortactin蛋白、细胞培养上清液MUC5AC的相对分泌量显著下降(p值均0.01),但MUC5AC的转录水平未受明显影响(p0.05);但SS+pcDNA3-Cortactin ~(421)-MU组和SS+pcDNA3-Cortactin ~(482)-MU组的p-Cortactin蛋白、MUC5AC mRNA表达、培养上清液MUC5AC的分泌量较SS+野生型Cortactin组均无显著差异(p0.05)。结论:在剪应力刺激诱导的气道上皮细胞MUC5AC高分泌过程中,Cortactin具有重要的介导作用,酪氨酸磷酸化位点Y466突变后,MUC5AC的分泌将受到明显阻断。
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R56
【图文】：

图 2.1 各组细胞 Cortactin 的相对表达水平A. Control group; B. wild-Cortactin group C. pcDNA3- Cortactin4D. pcDNA3- Cortactin466-MU group; E. pcDNA3- Cortactin482-MNote: *P<0.01 compared with control group.细胞 p-Cortactin 水平表达情况 印迹法检测后发现，单纯剪应力（SS）刺激下，p-cortac组显著升高（p<0.01），说明气道剪应力可促进 Cortactin 蛋 刺激组相比，转染野生型 Cortactin 后，再予 SS 刺激，p显增加（p<0.01）；与 SS+野生型 Cortactin 组相比，SS+pcDN的 p-Cortactin 蛋白水平显著下降（p<0.01），而 SS+pcDN和 SS+pcDNA3- Cortactin482-MU 组的 p-Cortactin 蛋白水平5）（表 2.2、图 2.2）。表 2.2 各组细胞 p-Cortactin 的相对表达水平( ，n=6)

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本文编号：2801163