军团菌的细胞内药敏试验及医院供水系统存活军团菌的定量检测

发布时间：2020-08-22 19:43

【摘要】：第一部分大环内酯类和氟喹诺酮类药物对细胞内军团菌的作用目的：评估大环内酯类和氟喹诺酮类药物对巨噬细胞内嗜肺军团菌的作用。方法：采用琼脂稀释法测量大环内酯类和氟喹诺酮类药物对20株嗜肺军团菌血清1型(L. pneumophila serogroup 1, Lp-1)的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC)。加入佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)将人类单核细胞系THP-1诱导分化成巨噬细胞样的细胞。将Lp-1与分化的THP-1细胞共培养,细胞吞噬细菌后,加入红霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、莫西沙星4种抗菌药物在1×MIC、4×MIC、8×MIC浓度时培养24h,平板计数法双份计数细胞内存活的军团菌数。结果以细菌抑制率表示,不同抗菌药物作用的差别采用Mann-Whitney U检验分析。结果：4种抗菌药物在1×MIC、4×MIC、8×MIC浓度时作用24h后细菌抑制率分别为：红霉素：1×MIC(50.18±27.29)%,4×MIC(79.48±20.08)%,8×MIC(91.46±8.70)%；阿奇霉素：1×MIC(66.77±26.18)%,4×MIC(91.73±8.72)%,8×MIC(97.10±3.37)%；左氧氟沙星：1×MIC(99.84±0.25)%,4×MIC(99.99±0.02)%,8×MIC(99.99±0.01)%；莫西沙星：1×MIC(99.90±0.10)%,4×MIC(99.99±0.03)%,8×MIC(99.99±0.03)%。氟喹诺酮类药物在1×MIC、4×MIC、8×MIC时对细胞内的Lp-1的抑制率显著高于大环内酯类药物(U值分别为1.0、2.0和5.0,K0.05),左氧氟沙星和莫西沙星在上述3个浓度时对Lp-1的抑制率无明显差别(U值分别为190、183和217,P0.05),阿奇霉素对细胞内Lp-1的抑制率高于红霉素(U值分别为132、128和125,P0.05)。结论：氟喹诺酮类药物的细胞内抗军团菌作用优于大环内酯类药物,左氧氟沙星和莫西沙星的细胞内抗军团菌作用无显著差别,阿奇霉素的胞内抗军团菌作用优于红霉素。第二部分采用EMA-qPCR方法定量检测医院供水系统存活的军团菌目的：采用EMA (Ethidium monoazide)和Real time PCR(qPCR)结合的方法(EMA-qPCR)研究上海市医院供水系统存活军团菌的污染情况,并与qPCR和培养的结果进行比较。方法：应用不同浓度的EMA与qPCR结合定量加热处理和不加热处理的军团菌,同时采用Baclight Live/Dead细菌存活试剂盒分析作为标准,确定EMA-qPCR的最佳EMA浓度。分别采用EMA-qPCR、qPCR和培养法定量检测热处理(70℃,1h)和含氯消毒剂(自由氯浓度为10mg/L,1h)处理后的军团菌的数量。随后采用上述三种方法对上海市2家医院50个病房供水系统中的军团菌进行定量检测。结果：EMA-qPCR的最佳EMA浓度为2.5ug/mL。采用EMA-qPCR、qPCR、培养法检测消毒处理后军团菌的数量(Log(Lp-1/mL))分别为：热处理4.0、7.87、0；氯处理3.8、7.61、1.34。EMA-qPCR检测医院供水系统水样中军团菌阳性的标本数为48份,其中浓度≥103GU/L的水样为40份(80.0%),浓度≥104Gu/L的水样为7份(14.0%),浓度≥105GU/L的水样为1份(2.0%)。采用EMA-qPCR、qPCR和培养三种方法测定军团菌属的数量分别为(7.75±22.4)×103GU/L,(2.37±6.71)x104GU/L,(3.80±25.50)x102CFU/L；嗜肺军团菌的数量分别为(8.40±2.47)×102GU/L,(1.11±2.65)×103Gu/L,(2.15±43.87)x102CFU/L。结论：EMA-qPCR可以更快速、准确地评估消毒效果。医院供水系统中存活军团菌的浓度较高,且相当大一部分军团菌处于“活着但不能被培养”的状态,需要有效的消毒方法去除军团菌污染。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R563.1
【图文】：

透射电镜,数量变化,培养的,细胞

Lp一1分别在THP一l细胞和细胞培养液中培养的数量变化

抗菌药物,细胞内,吞噬体

复旦大学硕士学位论文图2THP一1细胞吞噬Lp一1后oh(a)、sh(b)和24h(e)的电镜图片。a:箭头指示的为包含Lp一1的吞噬体(x4800)。b:THP且吞噬Lp一18h后的图片，箭头指示的为含有Lp一1的吞噬体周围被粗面内质网所包绕(X15000)。c:THP一1吞噬LP一124h后的图片，箭头指示的为含有Lp一1的吞噬体膜部分破裂，军团菌被释放到胞质中(x4800)。4.抗菌药物对细胞内Lp一1的作用4种抗菌药物在1xMIC、4xMIC、sxM工C时作用24h后，细胞内存活的Lp一1数量见图3，24h细菌抑制率见表1。

军团菌

EMA处理加热与未加热军团菌的EMA一qPCR结果见图1。(1)EMA处理加热后的军团菌与未经EMA处理的对照组相比，加热处理的Lp一在E毗浓度为lug/mL、2.sug/mL、sug/mL、10ug/mL、Zoug/mL时，EMA一qPeR检测结果(Log，。(LP一1))分别为5.55、4.90、4.42、3.93、3.15。BaeLightLive/Dead细菌存活试剂盒检测加热处理的LP--1中存活的军团菌数量(Logl。(Lp一1))为5.12。根据Mann一WhitneyU检验，当EMA浓度为2.sug/mL时，EMA一qPCR与BacLightLive/Dead细菌存活试剂盒检测结果无统计学差异(尸>0.05)。(2)EMA处理未加热的军团菌EMA浓度为2.sug/mL时，EMA一qPCR检测未加热的军团菌的数量为7.9个109值，与BacLightLive/Dead细菌存活试剂盒检测结果差异无统计学意义(Z)0.05)。EMA浓度为2.su岁mL时，EMAseqPCR区别存活与死亡军团菌的能力最佳。

【参考文献】