蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠肺纤维化的抑制作用及机制初探

发布时间：2020-09-27 11:47

　　背景:肺纤维化是一种慢性、致死性肺部疾病,是机体在多种体内外因素作用下,导致基底膜完整性遭到一定破坏,其上皮细胞及内皮细胞再生能力减弱,并伴随纤维化组织增生,最终形成纤维化病灶。发病机制复杂,亦缺乏有效治疗方案,预后极差。因此,进一步探索改善肺纤维化有效策略是必要的。研究表明,内皮-间质转化(Endothelial-mesenchymal Transition,EndMT)是各大重要器官发生纤维化机制之一。TGF-β1是调控纤维化EndMT的关键细胞因子。TGF-β1信号传导通路中重要信号转导因子为Smad蛋白,而受体抑制型蛋白中Smad7在TGF-β1信号传导通路中起主要作用。Smad7与TGF-βI型受体结合对TGF-β1信号传导起负调控作用。泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP)可对绝大部分真核细胞内蛋白特异性降解。Smad泛素化调节因子2(Smad Ubiquitin Regulatory Factor2,Smurf2)是泛素连接酶E3中的一种,其在TGF-β1/Smad7信号传导通路中,主要通过泛素化降解Smad7参与纤维化发生、发展。MG132是一种与蛋白酶体结合能可逆地抑制蛋白酶体活性的醛基肽类蛋白酶体抑制剂,目前已在实验研究领域中得到广泛应用。研究表明,MG132能减轻心、肝、肾、皮肤等重要器官纤维化发生发展。但在肺纤维化中研究甚少,机制尚不明确。目的:通过检测内皮细胞表型(CD31)、间质细胞表型(α-SMA)在肺纤维化不同时间点表达情况,了解EndMT在肺纤维化中作用以及变化特点;予以蛋白酶体抑制剂MG132干预成功建立的肺纤维化大鼠模型,通过检测CD31、α-SMA、Smurf2、TGF-β1、Smad7的表达,探讨泛素蛋白酶体抑制剂MG132对肺纤维化EndMT的影响及Smurf2-Smad7信号在肺纤维化EndMT中调控机制。方法:选取96只健康雄性SD大鼠,随机分为四组(对照组、BLM组、DMSO组、MG132组),每组24只。BLM组、DMSO组、MG132组大鼠气管内注入0.3ml(5mg/kg)博莱霉素溶液诱导肺纤维化动物模型;对照组大鼠气管内注入0.3ml生理盐水。造模后第1天开始,MG132组大鼠每日腹腔注射0.3ml(0.1mg/kg/d)MG132溶液;BLM组每日腹腔注射0.3ml生理盐水;DMSO组每日腹腔注射0.3ml DMSO溶媒溶液;对照组每日腹腔注射0.3ml生理盐水。各组大鼠分别于第7、14、28天随机处死8只,所取出肺组织用于HE染色、Masson染色、羟脯氨酸含量测定、Ashcroft评分评估大鼠肺纤维化程度;免疫组化检测第7、14、28天大鼠Smurf2、TGF-β1、Smad7、CD31、α-SMA表达情况,RT-PCR检测分析Smurf2、TGF-β1、Smad7 mRNA表达情况。结果:(1)大鼠一般情况:第7、14、28天,对照组大鼠一般情况佳,反应灵敏、摄食正常、活动尚可、呼吸平稳;BLM组大鼠反应逐渐迟钝、摄食逐渐减少、活动逐渐减少、呼吸逐渐加快;DMSO组大鼠表现与BLM组相似;MG132组大鼠反应、摄食、活动、呼吸均介于对照组与BLM组间。第16天,MG132组大鼠死亡1只,考虑因药物腹腔注射出现中腹膜炎导致死亡可能性大。(2)肺纤维化指标检测:第7、14、28天,肺组织肺纤维化指标测定均提示,与对照组比较,BLM组大鼠肺组织纤维化指标均明显增加(P0.05),且早期变化速率明显高于晚期;DMSO组大鼠肺组织纤维化指标表达与BLM组大鼠相似(P0.05);MG132组大鼠肺组织纤维化指标较BLM组有所减少(P0.05),但较对照组增加(P0.05)。(3)肺组织Smurf2、TGF-β1、Smad7、CD31、α-SMA免疫组化检测:第7、14、28天,与对照组相比,BLM组大鼠肺组织纤维化程度明显加重,CD31表达阳性区逐渐减少,α-SMA表达阳性区渐增加,Smurf2、TGF-β1表达阳性区逐渐增加,而Smad7表达阳性区域逐渐减少(P0.05);DMSO组大鼠肺组织上述免疫组化结果与BLM组大鼠相似(P0.05);MG132组大鼠肺组织免疫组化结果介于BLM组与对照组之间(P0.05)。(4)RT-PCR检测Smurf2、TGF-β1、Smad7 mRNA表达结果:第7、14、28天,与对照组比较,BLM组大鼠肺组织Smurf2、TGF-β1 mRNA表达显著上调(P0.05),Smad7 mRNA表达明显下调(P0.05);DMSO组大鼠肺组织Smurf2、TGF-β1、Smad7 mRNA表达与BLM组相似(P0.05);MG132组大鼠肺组织Smurf2、TGF-β1、Smad7 mRNA表达介于BLM组与对照组之间(P0.05)。且Smurf2 mRNA表达与大鼠肺组织纤维化程度及TGF-β1 mRNA表达呈正相关,与Smad7 mRNA表达呈负相关。结论:1、EndMT参与肺纤维化的形成,发生EndMT高峰在第14天;2、蛋白酶体抑制剂MG132参与调控大鼠肺纤维化EndMT,从而抑制肺纤维化发生发展;3、蛋白酶体抑制剂MG132可通过调节Smurf2-Smad7信号传导,调控大鼠肺纤维化EndMT,从而抑制肺纤维化发生发展;4、Smurf2可能成为临床防治肺纤维化发生、发展的一个新靶点。
【学位单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R563
【部分图文】：

肺组织,大鼠

15图 2-1 各组大鼠肺组织大体改变Fig.2-1 General changes of rats lung tissue in each group：① A7、A14、A28 分别表示为对照组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织；② B7、B14、B28 分别表示为 BLM 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织；③ C7、C14、C28 分别表示为 DMSO 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织；④ D7、D14、D28 分别表示为 MG132 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织。

HE染色,肺组织,大鼠,胶原沉积

图 2-2 各组大鼠肺组织 HE 染色（100×）Fig.2-2 HE staining of rats lung tissue in each group（100×）：① A7、A14、A28 分别表示为对照组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织 HE 染色；② B7、B14、B28 分别表示为 BLM 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织 HE 染色③ C7、C14、C28 分别表示为 DMSO 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织 HE 染色④ D7、D14、D28 分别表示为 MG132 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织 HE 染色2.3 Masson 染色显微镜下表现① 对照组：第 7、14、28 天肺组织肺泡形态结构正常，镜下未见明显蓝色胶原沉积，第 7、14、28 天组内两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）；② BLM 组：第 7 天肺组织肺泡形态结构有所破坏，肺泡腔可内渗出的炎性细胞，镜下见少量蓝色纤维胶原沉积；第 14、28 天，大鼠肺组织形态结构明显破坏镜下见大量蓝色胶原沉积；与对照组相比，蓝染胶原面积明显增加，纤维化程度明显加重（P＜0.05），组内两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）；③ DMSO 组：第 7、14、28 天，大鼠肺组织 Masson 染色镜下所见与 BLM 组

肺组织,大鼠

18图 2-3-1 各组大鼠肺组织 Masson 染色（100×）Fig.2-3-1 Masson staining of rats lung tissue in each group（100×）注：① A7、A14、A28 分别表示为对照组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织 Masson 染色② B7、B14、B28 分别表示 BLM 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织 Masson 染色③ C7、C14、C28 分别表示为 DMSO 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织 Masso染色；④ D7、D14、D28 分别表示为 MG132 组大鼠第 7 天、第 14 天、第 28 天肺组织 Mass染色。

【参考文献】