hAng1腺病毒载体的构建及其对内毒素性肺损伤炎症消退的影响

发布时间：2020-09-29 11:26

　　 目的克隆人血管生成素1基因(hAng1),采用AdMax包装系统构建含人血管生成素1的重组腺病毒质粒,为研究血管生成素1对急性肺损伤中炎症消退的作用奠定基础。方法将hAng1 cDNA克隆于真核表达载体pDC315-EGFP,得到重组质粒pDC315-EGFP-Ang1,采用位点特异性重组系统(Cre/Loxp)将pDC315-EGFP-Angl与pBHG lox△E1,3Cre辅助包装质粒共转染至HEK293细胞,生成带有Angl基因的重组腺病毒载体Ad-EGFP-Ang1,重组腺病毒质粒在HEK293细胞中扩增,氯化铯梯度离心纯化。检测转染的HEK293细胞中以及细胞培养上清中的Ang1蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实载体构建的正确性,病毒滴度为1.5×1012 PFU·mL-1。Ad-EGFP-Ang1转染的HEK293细胞和细胞培养上清中均检测出Ang1蛋白。结论带有hAng1 cDNA的重组腺病毒载体构建成功,可用于对急性肺损伤炎症消退的影响的研究。 目的气管滴入脂多糖复制小鼠急性肺损伤模型,为进一步探讨炎症反应过程奠定基础。方法将20只SPF级雄性BALB/c小鼠(20-25g)随机分为对照组和脂多糖组,每组10只小鼠,麻醉后分别经气管插管滴入生理盐水(对照组)和脂多糖3mg·kg-1(脂多糖组)。观察24小时死亡率、肺组织湿干重比、病理改变,肺泡灌洗液中的白细胞计数、中性粒细胞计数和总蛋白浓度。结果脂多糖组小鼠死亡率33.3%,对照组没有小鼠死亡。脂多糖组肺组织病理评分、肺组织湿干重比、肺泡灌洗液中的白细胞计数、中性粒细胞计数和总蛋白浓度均高于对照组,(P=0.001)。结论气管滴入脂多糖3 mg·kg-1成功模拟了ALI的过程,是进一步探讨炎症反应过程的可靠的ALI动物模型。 目的通过基因转染增加血清中血管生成素1(Angl)的浓度,探讨血管生成素1基因治疗对急性肺损伤炎症消退的影响。方法SPF级BALB/c小鼠气管内滴入脂多糖构建急性肺损伤动物模型前,经尾静脉注入空载体病毒(Ad-GFP, GFP组)或者携带血管生成素1的腺病毒(Ad-GFP-Ag1, Ang1组)。经气管滴入脂多糖后4h、12h、24h、48h、72h、96h处死小鼠,取肺泡灌洗液收集细胞,行细胞计数分类,并用流式检测中性粒细胞凋亡和被巨噬细胞吞噬情况。收集肺组织和肝脏组织以及血清,检测血管生成素1的基因和蛋白表达。检测肺泡灌洗液中的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子浓度变化。另外取4只小鼠,静脉注入空载体病毒,24小时后气管滴入生理盐水作对照组。结果LPS气管滴入后大量的白细胞浸润到肺组织和肺泡腔,早期以中性粒细胞为主,在48h白细胞和中性粒细胞达到最大值。Angl预处理增加了angl在肝脏的表达,分泌到血清中,减少了炎性细胞浸润并促进了中性粒细胞的凋亡和吞噬,从而加速了中性粒细胞从组织的清除,同时,增加了肺泡灌洗液中的粒细胞单核细胞集落刺激因子浓度。结论血管生成素1预处理促进了急性肺损伤炎症消退,这与其促进中性粒细胞的凋亡和巨噬细胞吞噬有关。 1经颈透照明视下完成并证实小鼠气管插管成功,经气管插管滴入3mg·kg-1脂多糖可以成功复制ALI模型。 2脂多糖3mg·kg-1气管滴入后48小时,肺组织炎症达高峰,随后进入炎症消退期。血管生成素1预处理有效的稳定血管内皮细胞,减少蛋白渗出,抑制了炎症细胞组织浸润。 3血管生成素1促进了急性肺损伤炎症消退。其机制是血管生成素1通过稳定血管内皮细胞促进炎症组织中性粒细胞凋亡,促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞。 4血管内皮细胞参与了炎症消退过程。 5血管内皮细胞可能是急性肺损伤防治的一个重要的潜在的靶点。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R563
【部分图文】：

材料载体 PDC315一EGFPvector有上海吉凯基因技术有限公司构建。(图1一l) ITRAd.I.m.nt mCMVPromoter灭五 01(807)OC3，5干AmP五心pR皿归则〕EGF尸闷M.祝PDC315很图1一1真核表达载体信息l6

这个系统的工作原理是将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒同携带了腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共同转染HEK293细胞，利用 Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。(图1一2)AdMax”，ror罗倪ra吸协 norAd亡nov色麟、玫tO“1侧FO曰叫卜司卜灿C代‘牙FLI.△民3肠七I一仁二厂食一黑.A毕吞E..\入记loxl， or介tGe.旧日 nlePl.，nid+Ap’以yr皿A、SE〔.】，书3CFI」求.p种 fnfr.-加二UO. IoxPof介t.1双闷...犷ror户甸，DNA杏’0甸“I下只.州卜△ElA助RCCornbin幼 tViralVcCtor图1一 2AdMax腺病毒包装系统(三)辅助包装质 粒:pBHGlox△El， 3Cre辅助包装质粒(丛鱼红剑丛荃.Canad

华中科技大学博士学位论文图1一6目的质粒在HEK293细胞中的荧光表达图a为细胞白光照片，图b为细胞荧光照片。放大倍数200倍。图1一 7HEK293细胞中Angl蛋白表达泳道说明:WBSTDool为WB标准品，阳性对照Con为293T细胞样品;KL884一1、一2为目的质 粒(PDC315一GFp一Angl)转染293T后样品。

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本文编号：2829660