TLR4-PI3K-Rac1通路对巨噬细胞骨架及吞噬功能的影响

发布时间：2020-10-12 17:35

　　 背景及目的慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)肺泡巨噬细胞(AM)吞噬功能降低且与细胞骨架异常重排有关。Toll样受体(TLR)4可能通过调控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Ras相关的C3肉毒素底物(Rac)1信号通路参与AM细胞骨架重排及吞噬过程,且国内外研究罕见。直接体内获取原代AM并进行传代较为困难,且不易进行RNA干扰(RNAi)等技术干预,小鼠巨噬细胞系RAW264.7保留巨噬细胞吞噬及粘附功能,可稳定传代并可进行RNAi等技术干预。故本研究选用RAW264.7细胞为研究对象,探讨TLR4-PI3K-Rac1信号通路在巨噬细胞骨架重排及吞噬功能中的作用。方法RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及TLR4-RNAi组。构建3个携带TLR4基因短发卡RNA(shRNA)的质粒及1个携带无意义shRNA序列的阴性对照质粒,采用脂质体转染法分别转染RAW264.7细胞。筛选转染效率最高的一条TLR4-shRNA,将TLR4-shRNA及无意义对照序列shRNA进行慢病毒包装,将携带TLR4-shRNA及携带无意义对照序列的慢病毒颗粒分别转染至TLR4-RNAi组及阴性对照组,空白组不进行转染。蛋白印迹法(Western blot)检测TLR4基因沉默效率。实时荧光定量PCR检测各组细胞PI3K、Rac1 mRNA的表达,Western blot测各组细胞PI3K、磷酸化Rac1(p-Rac1)、Rac1蛋白表达;激光共聚焦显微镜观察细胞骨架变化。流式细胞术检测各组细胞吞噬异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌(FITC-E.coli)的能力,用平均荧光强度(MFI)和吞噬细胞百分比(吞噬%)表示。结果(1)转染效率及沉默效率检测:TLR4-shRNA质粒及慢病毒可成功转染RAW264.7细胞,转染效率大于80%,TLR4基因沉默效率为(63?4)%;(2)各组TLR4 mRNA和蛋白表达:TLR4-RNAi组TLR4 mRNA和蛋白表达(0.20?0.03、0.37?0.04)均低于空白组和阴性对照组[(1.00?0.00、1.00?0.05)和(0.98?0.09、0.97?0.07)](均P0.01);阴性对照组和空白组相比差异无统计学意义;(3)各组PI3K mRNA和蛋白表达:TLR4-RNAi组PI3K mRNA和蛋白表达(0.64?0.06、0.75?0.06)均低于空白组和阴性对照组[(1.00?0.00、1.00?0.08)和(0.98?0.05、1.00?0.09)](均P0.01);阴性对照组和空白组相比差异无统计学意义;(4)各组Rac1 mRNA和蛋白表达:TLR4-RNAi组Rac1 mRNA、蛋白和p-Rac1蛋白表达(0.75?0.04、0.76?0.01、0.74?0.05)均低于空白组和阴性对照组[(1.00?0.00、1.02?0.05、1.00?0.06)和(0.96?0.10、1.07?0.09、1.00?0.06)](均P0.01),阴性对照组和空白组相比差异无统计学意义(5)细胞骨架变化:TLR4-RNAi组RAW264.7细胞伪足伸出短少、僵硬,细胞内吞噬的FITC-E.coli较少,空白组和阴性对照组RAW264.7细胞伪足伸出良好,吞噬的FITC-E.coli较多。(6)各组细胞吞噬FITC-E.coli能力:TLR4-RNAi组MFI和吞噬%[(7453?564)、(70.20?2.27)%]均低于空白组和阴性对照组[(11733?935)、(79.97?1.07)%和(10983?954)、(79.60?1.17)%](均P0.01),阴性对照组MFI和吞噬%与空白组相比差异无统计学意义。(7)相关性分析:基础状态下及RNAi干预后TLR4 mRNA和蛋白与PI3K、Rac1 mRNA和蛋白及p-Rac1蛋白均呈正相关(均P(27)0.05),基础状态下及RNAi干预后,PI3K mRNA、蛋白表达与Rac1 mRNA、蛋白及p-Rac1蛋白均呈正相关(均P(27)0.05),基础状态下及RNAi干预后,TLR4、PI3K、Rac1 mRAN和蛋白及p-Rac1蛋白与MFI、吞噬%均呈正相关(均P(27)0.05)。结论TLR4-shRNA质粒和慢病毒可成功转染RAW264.7细胞,沉默TLR4基因;TLR4-PI3K-Rac1信号通路调控巨噬细胞吞噬功能;沉默TLR4基因可以抑制PI3K-Rac1信号通路,使巨噬细胞骨架排列紊乱、吞噬功能降低。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R563.9
【部分图文】：

兰州大学硕士学位论文 TLR4-PI3K-Rac1 通路对巨噬细胞骨架及吞噬功能的影响ΔCt(其它组)=Ct(其它组目的基因)-Ct(内参)ΔΔCt=ΔCt(其它组)-ΔCt(空白组)

兰州大学硕士学位论文 TLR4-PI3K-Rac1 通路对巨噬细胞骨架及吞噬功能的影响ΔCt(其它组)=Ct(其它组目的基因)-Ct(内参)ΔΔCt=ΔCt(其它组)-ΔCt(空白组)图 1 实验样品中 TLR4 的扩增曲线和熔解曲线

图 4 蛋白浓度测定标准曲线-PAGE 凝胶电泳胶前，准备所用器械及仪器，先用自来水彻底冲洗玻璃水洗涤一遍，擦拭晾干后将玻璃板卡在夹子上，进行检水注入夹子中的两块玻璃板之间，记录液面高度，等待否下降，如玻璃板无液体漏出，即可进行下一步配胶操胶：根据所测基因大小选择合适浓度的分离胶，因此需分离胶各一块(表 3)，因 AP 和 TEMED 会使胶迅速凝固TEMED 且加入后立即快速摇匀，用移液枪吸取凝胶注入面接近刻度时，应减慢注胶速度，保证凝胶液面水平，注满水，液封的胶凝固速度快；约 10min 后，在分离胶与，表示胶已凝固。胶：待分离胶胶自然凝固后，彻底弃去玻璃板中的水；；配置完成后，用移液枪吸取浓缩胶加入玻璃板中，使其
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本文编号：2838067