TLR4基因转染树突状细胞对支气管哮喘的免疫调节作用

发布时间：2020-10-13 13:57

　　 背景 支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,属于超敏反应性质,多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子与其发生发展有关,其中辅助T细胞亚群(Th1/Th2)的失衡、Th2细胞数量增加、功能活化起着关键作用。树突状细胞是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞(APC),系已知唯一能活化初始T细胞的APC,是识别内外源性抗原、调节天然免疫和获得性免疫的关键因素。已知分布于气道的DC是呼吸道免疫防御的前哨细胞,在通过胞饮、吞噬或受体介导的内吞三种方式摄取吸入性抗原后逐渐成熟,趋化因子、共刺激分子和MHCI工类分子表达增加,而FcγRII、FcγRI和FcεRI等表达减少,并于24小时内从气道迁移至纵隔淋巴结产生初级免疫应答,促使初始Th细胞(Th0)向Th1或Th2分化。Tho的活化需DC参与的抗原识别信号和协同刺激信号,其分化方向受控于抗原刺激后DC分泌的细胞因子,IL-12和IFN—γ是诱导Th0向Th1分化的重要细胞因子。许多试验显示DC的免疫调节作用与其细胞膜表面TLR的表达有关,一般认为相应P/NP通过TLR4激活DC主要引起IL-12p70、IFN-γ介导蛋白(IP-10)等细胞因子大量增加。鉴于树突状细胞TLR4对于T细胞分化的调节作用,若将TLR4基因通过腺病毒载体导入抗原(如LPS)激发的DC,可促使DC分泌较多的IFN-γ等,上调Th0表达的IL-12Rβ2和TLR4,从而利于Th0向Th1分化。 目的将转染了TLR4基因和LPS致敏的DC输入OVA诱导的过敏性哮喘模型小鼠体内,以促进Th1的分化,逆转过敏性哮喘的Th亚群失衡,从而通过TLR4基因转移DC干预的免疫调节方式探讨哮喘基因治疗的新方法。 方法 1.利用RT-PCR方法,从Balb/c小鼠脾组织细胞mRNA中扩增TLR4基因全长cDNA,并将其连接到pcDNA3.1(+)载体上,进行测序和核酸分析。 2.采用AdMax包装系统,将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞,利用Cre/loxP系统的作用实现重组,产生重组腺病毒。RT-PCR方法检测AdV-TLR4mRNA在传代DC中的表达、Western Blot方法检测AdV-TLR4蛋白的表达。 3.RT-PCR方法检测AdV-TLR4转染的DCIL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA表达的变化;ELISA方法检测AdV—TLR4转染的DC培养上清IL-12、IL-4和IFN-Y的表达水平;流式细胞仪分析AdV—TLR4转染的DC表面免疫特性标志蛋白Ia、CD40、CD80和CD 86的改变。 4.0.1%OVAAl(0H)_3溶液皮下注射、1%OVA的生理盐水溶液雾化吸入的方法制备小鼠哮喘模型;福尔马林组织固定、包埋、切片,HE染色和AB/PAS复染进行小鼠肺组织学形态观察,Gimsa-Wright染色观察BALF中Eos;骨髓细胞分离,红细胞裂解液处理,GM-CSF和IL-4诱导、RMPI1640完全培养基培养的方式获取DC,行哮喘小鼠DCTLR4mRNA和TLR4蛋白表达检测;ELISA方法检测小鼠脾细胞IL-4、IL-5、IFN-Y和血浆IgE含量、人血浆IL-4和IgE含量、BALF中IL-4和IgE含量;流式细胞仪方法检测脾细胞CD4+CD25+细胞百分比。 结果 1.扩增得到的小鼠TLR4基因cDNA全长2508bp,编码536个氨基酸,blast结果分析表明,该cDNA与Genbank中发表的序列(NM021297)具有100%的同源性。 2.重组质粒pDC316—mTLR4的PCR及酶切鉴定表明,TLR4基因被定向插入;与pBHGF35骨架质粒共转染293细胞并包装成病毒,经病毒DNA的PCR检测,证实已完成对重组病毒的包装;重组病毒转染小鼠DC,其TLR4mRNA和TLR4蛋白均明显表达。 3.诱导Th1细胞分化的IL-12、IFN-γ在Ad-TLR4转染DC后48小时表达量明显增高,而诱导Th2细胞分化的IL-4表达量明显降低;转染细胞的PCR检测显示IL-12 mRNA、IL-4 mRNA和IFN-Y mRNA的变化与相应蛋白表达量的变化具有一致性;LPS实验进一步证实显示,LPS对转染细胞表达细胞因子的影响与LPS有关,LPS(+)转染DC组上述细胞因子改变的幅度高于LPS(-)组,LPS具有促进和加强Ad-TLR4-DC的某些生物学特性的改变。流式细胞检测表明Ad5F35-mTLR4组DC细胞CD 86表达较对照组和Ad5F35一mCMV-EGFP明显增高;进一步的实验显示,Ad5F35-mTLR4转染DC LPS(+)组Ia、CD40和CD80表达较相应LPS(-)明显增高;LPS(+)对照组CD80和CD 86表达也较相应LPS(-)组明显增高。LPS具有促进和加强Ad-TLR4-DC细胞表面某些免疫特性标志蛋白的改变。 4.TLR4 DC悬液给予过敏性哮喘模型小鼠,显示表现为杯状细胞增生减少、气道内粘液减少,WBC数、Eso比率和IL-4水平均降低,而免疫调节性T细胞CD4+CD25+细胞百分率增高,显示TLR4 DC具有明显的抗支气管哮喘作用。TLR4 DC抗支气管哮喘的机制,推测与TLR4 DC激发使具有调节T细胞分化的细胞因子改变有关,如IFN-γ增加可促使Th1分化;TLR4DC进入机体还促使了免疫调节性T细胞CD4+CD25+增加,免疫调节性T细CD4+CD25+可增加机体对过敏物质的耐受性,进而可减轻其炎症反应。 结论 1.成功构建了小鼠TLR4基因的全长编码区cDNA。 2.重组病毒感染滴度为2.3×10~8 IU/ml,可用于体内外动物实验。在本研究中作为TLR4基因干预对机体Th1/Th2平衡影响的研究工具。 3.LPS促进Ad-TLR4-DC细胞表面Ia、CD40、CD80和CD 86免疫特性标志蛋白改变,促进DCIL-12、IL-4和IFN-γ表达改变,推测这些改变与DCTLR4信号传导有关。 4.TLR4 DC对OVA诱导的支气管炎症反应有一定抑制作用,LPS与TLR4有一定的协调作用,其机制与DC的免疫调节作用有关。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R562.25
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 TLRs与哮喘炎症细胞和食品营养关系研究
    1.1 引言
    1.2 支气管哮喘免疫学
    1.3 TLR的生物学
    1.4 TLRs及T淋巴细胞与支气管哮喘
        1.4.1 TLR在Th1型免疫应答中的作用
        1.4.2 TLRs在Th2型免疫应答中的作用
    1.5 TLRs及肥大细胞与支气管哮喘
    1.6 TLRs及肺上皮细胞与支气管哮喘
        1.6.1 支气管上皮细胞与哮喘
        1.6.2 Ⅱ型上皮细胞与哮喘
        1.6.3 TLR s和Ⅱ型上皮细胞在哮喘中的作用
    1.7 TLRs及DC与支气管哮喘
    1.8 DC和TLRs干预治疗支气管哮喘展望
    1.9 TLRs与食品营养关系
        1.9.1 益生菌及作用机制
        1.9.2 TLR、食品与健康
    参考文献
第二章 小鼠TLR4基因克隆和鉴定
    2.1 引言
    2.2 实验材料和仪器
        2.2.1 料和试剂
        2.2.2 主要实验仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 引物设计与合成
        2.3.2 小鼠脾组织细胞总RNA的提取
        2.3.3 RT-PCR
        2.3.4 PCR产物的DNA重组和克隆
        2.3.5 阳性克隆的筛选
        2.3.6 鉴定与分析
    2.4 结果
        2.4.1 RT PCR扩增TLR4基因
        2.4.2 重组质粒pcDNA3.1(+)TLR4的酶切及PCR鉴定
        2.4.3 小鼠TLR4基因的序列分析
    2.5 分析讨论
        2.5.1 小鼠TLR4基因的表达蛋白
        2.5.2 小鼠TLR4基因
        2.5.3 小鼠TLR4基因克隆及其对支气管哮喘的意义
    参考文献
第三章 小鼠TLR4基因腺病毒载体的构建
    3.1 引言
    3.2 实验材料和仪器
        3.2.1 材料和试剂
        3.2.2 实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 含目标基因的穿梭质粒的构建
        3.3.2 阳性克隆的筛选与鉴定
        3.3.3 构建后质粒鉴定
        3.3.4 重组腺病毒在293细胞中的包装
        3.3.5 Ad5F35-mTLR4鉴定
        3.3.6 病毒活性确定
    3.4 结果
        3.4.1 穿梭质粒连接产物鉴定
        3.4.2 含pDC316-mTLR4菌液的PCR鉴定
        3.4.3 pDC316-mTLR4质粒的酶切鉴定
        3.4.4 pDC316-mTLR4测序鉴定
        3.4.5 293细胞中Ad V-TLR4病毒包装
        3.4.6 Ad5F35-mTLR4的PCR鉴定
    3.5 讨论
        3.5.1 病毒载体
        3.5.2 病毒载体的包装系统
        3.5.3 病毒载体的纯化
        3.5.4 腺病毒及其腺病毒载体
        3.5.5 常用腺病毒载体的包装方法
        3.5.6 腺病毒载体Ad5/F35
        3.5.7 Ad5F35-mTLR4
    参考文献
第四章 TLR4腺病毒载体转染在DC的表达观察
    4.1 引言
    4.2 实验材料和仪器
        4.2.1 材料和试剂
        4.2.2 实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 DC的倒置显微镜和电镜观察
        4.3.2 病毒载体侵染DC细胞Ad5F35-mTLR4感染DC细胞:
        4.3.3 适当MOI值确定
        4.3.4 TLR4mRNA定性表达检测
        4.3.5 TLR4mRNA定量表达检测
        4.3.6 TLR4蛋白表达检测
    4.4 结果
        4.4.1 DC形态学观察
        4.4.2 MOI值确定
        4.4.3 Ad5F35-mTLR4感染DC表达检测
    4.5 讨论
        4.5.1 DC疫苗
        4.5.2 DC疫苗目前的应用
        4.5.3 ad-TLR4-DC
    参考文献
第五章 TLR4腺病毒载体转染对DC表面标志和细胞因子表达的体外实验观察
    5.1 引言
        5.1.1 DC与支气管哮喘
        5.1.2 支气管哮喘与细胞因子紊乱
        5.1.3 体外实验观察的意义
    5.2 实验材料和仪器
        5.2.1 材料和试剂
        5.2.2 实验仪器
    5.3 实验方法
        5.3.1 DC培养和分组
        5.3.2 DC表面标志检测
        5.3.3 培养DC上清IL-12、IL-4和IFN-γ表达检测
        5.3.4 培养DCIL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA表达检测
        5.3.5 统计学分析
    5.4 结果
        5.4.1 Ad5F35-mTLR4转染对DC表面标志的影响
        5.4.2 Ad5F35-mTLR4转染对DCIL-12、IL-4和IFN-γ表达的影响
        5.4.3 Ad5F35-mTLR4转染DC对IL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA的影响
        5.4.4 LPS对不同DC组表面标志的影响
        5.4.5 LPS对不同DC组IL-12、IL-4和IFN-γ的影响
        5.4.6 LPS对不同DC组IL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA表达的影响
    5.5 分析讨论
        5.5.1 TLR信号传导系统
        5.5.2 Ia、CD40、CD80和CD86
        5.5.3 ID-12 IL-4和IFN-γ
        5.5.4 LPS脂多糖(Lipopolysacchride,LPS)
        5.5.5 TLR4对DC表面标志和细胞因子表达的影响
    参考文献
第六章 哮喘及TLR4转染DC体内免疫调节功能观察
    6.1 引言
        6.1.1 基因治疗概述
        6.1.2 以腺病毒载体为基础的基因治疗
        6.1.3 以DC为基础的基因治疗
        6.1.4 TLR4基因导入DC的基因疗法
    6.2 实验材料和仪器
        6.2.1 材料和试剂
        6.2.2 实验仪器
    6.3 实验方法
        6.3.1 小鼠哮喘模型制备
        6.3.2 小鼠肺组织学检测
        6.3.3 哮喘模型小鼠DC分离培养
        6.3.4 哮喘模型小鼠DC TLR4mRNA
        6.3.5 小鼠DC蛋白的提取及TLR4蛋白的Western Blotting检测
        6.3.6 哮喘患儿血浆IL-4、IgE测定
        6.3.7 老年性哮喘患者血浆和支气管灌洗液IL-4相关性分析
        6.3.8 TLR4转染DC的免疫调节功能观察
        6.3.9 小鼠TLR4DC制备
        6.3.10 小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞和Eos检测
        6.3.11 小鼠脾细胞IL-4、IL-5、IFN-γ和血浆IgE含量测定
        6.3.12 小鼠脾细胞CD4+CD25+细胞的百分比检测
        6.3.13 统计学处理
    6.4 结果
        6.4.1 哮喘模型小鼠肺组织学改变
        6.4.2 哮喘模型小鼠脾细胞培养上清细胞因子改变
        6.4.3 哮喘模型小鼠DC TLR4蛋白表达
        6.4.4 哮喘模型小鼠DC TLRmRNA分析
        6.4.5 不同人群IL-4、IgE及相关性检测
        6.4.6 TLR4DC对哮喘小鼠肺支气管组织形态的影响
        6.4.7 TLR4DC对哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液过敏炎症细胞数的影响
        6.4.8 TLR4DC对哮喘小鼠脾淋巴细胞IL-4、ID-5、IFN-γ和血清IgE的影响
        6.4.9 TLR4DC对哮喘小鼠脾淋巴细胞活性的影响
    6.5 分析讨论
        6.5.1 DC临床应用情况
        6.5.2 DC在支气管哮喘治疗中的应用
        6.5.3 ad-TLR4DC与支气管哮喘免疫调节
    参考文献
第七章 工作总结与展望
    7.1 主要结论
    7.2 研究创新
    7.3 工作展望
        7.3.1 病毒载体的免疫原性和安全性检测
        7.3.2 安全、高效、靶向和可调控病毒载体的研究和使用
        7.3.3 基因修饰DC的免疫治疗问题
        7.3.4 DC表面TLR研究
        7.3.5 DC的免疫耐受研究
        7.3.6 Tc1和Tc2群与DC关系
        7.3.7 临床基因治疗
    参考文献
在读期间发表的第一作者学术论文
致谢

【参考文献】

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