CDKN2B甲基化在肺纤维化发生发展中的作用及初步机制研究

发布时间：2020-10-13 14:42

　　 背景:肺纤维化是一种严重的结构破坏性肺间质疾病,其特点为早期肺上皮细胞炎症,随着病程进展,肺成纤维细胞/肌成纤维细胞过度活化,所产生的大量细胞外基质沉积在肺间质,从而破坏正常的肺部结构。虽然其致病原因不明且治疗手段较少,但已有证据表明,基因学和表观遗传学改变,比如DNA甲基化,在其中起着至关重要的作用。已有的大量研究表明,肺成纤维细胞是肺纤维化发生发展中的关键效应细胞。最近的一些研究证实,CDKN2B基因在肺纤维化病人肺成纤维细胞中存在差异甲基化状态,但其在肺纤维化发生发展中的具体作用及机制,目前尚没有相关报道。目的:通过构建肺纤维化实验动物模型,检测大鼠肺组织原代培养的成纤维细胞的CDKN2B启动子甲基化状态,对其在肺纤维化发生发展中的作用及机制进行初步研究。方法:1.将36只雄性Wistar大鼠随机地分成六个组:分别为对照组、模型组(博来霉素肺纤维化组)、非处理对照组、沙尘组(沙尘肺纤维化模型组)、沙尘5'-氮杂胞苷干预组(沙尘干预组)及博来霉素5'-氮杂胞苷干预组(博来霉素干预组)。对照组给予大鼠气管灌注生理盐水;模型组则给予大鼠气管内注射浓度为2.2mg/kg,约0.3ml配制好的博来霉素溶;沙尘组每天暴露于风洞模拟的沙尘暴环境中(设置总悬浮颗粒物浓度(TSP)约为9000μg/m~3)每周5天,每天5h,其余时间段生活环境均同非处理对照组;非处理对照组置于风洞旁通风干燥、恒温的正常生存环境中;沙尘干预组先暴露于风洞环境中(方法剂量同沙尘组),造模1月后予以腹腔注射5'-氮杂胞苷(1mg/kg,1ml);博来霉素干预组则在博来霉素气管注射(方法剂量同模型组)4天后给予腹腔注射5'-氮杂胞苷(方法同前);各组造模完成的时间分别为后3周,3周,24周,24周,24周,3周,然后麻醉、处死大鼠。2.评测肺纤维化动物模型构建成功与否的方法,包括肺组织苏木精一伊红染色(HE染色,Hematoxylin Eosin Staining)、masson三色染色等方法。3.大鼠肺成纤维细胞进行原代培养,提取细胞总脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA),应用亚硫酸氢盐焦磷酸测序(Bisulphite pyrosequencing,BSP)方法检检测对照组、模型组、非处理对照组、沙尘组大鼠肺成纤维细胞CDKN2B启动子的甲基化状态。4.利用生物信息学网站(KEGG PATHWAY Database)及生物医学与信息学检索网站PubMed,预测CDKN2B与纤维化相关的通路及上下游的靶基因。5.利用蛋白质印记(Western-blot)初步分析相关靶基因的表达。结果:1、对照组、模型组、博来霉素干预组、非处理对照组、沙尘组、沙尘干预组大鼠肺脏进行解剖分离、固定和染色,发现模型组、沙尘组均可引起不同程度的肺部损伤,包括肺部炎症、伴肺间质纤维组织增生、肺部小结节形成,而经腹腔注射5'-氮杂胞苷干预的沙尘干预组大鼠肺部炎症及纤维组织增生较沙尘组减少,博来霉素干预组大鼠肺部炎症及纤维组织增生较博来霉素组无明显变化或加重。2、沙尘组大鼠的肺成纤维细胞中CDKN2B启动子甲基化状态明显高于非处理对照组。3、对照组和模型组中CDKN2B启动子甲基化状态没有明显差异。4、CDKN2B高甲基化的沙尘组,其成纤维细胞的a-SMA表达增强。5、沙尘组的p-Smads蛋白表达高于非处理对照组。结论:1、大鼠肺成纤维细胞原代培养表明:沙尘颗粒物致肺纤维化的大鼠肺成纤维细胞中CDKN2B基因启动子区域存在高甲基化。2、CDKN2B基因甲基化可能是沙尘致肺纤维化形成的机制之一,即CDKN2B甲基化激活TGF-β/Smads这一信号通路,参与肺纤维化的发生与发展。3、博来霉素诱导的肺纤维化的发生与CDKN2B基因的甲基化无关。
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R563
【部分图文】：

宁夏医科大学硕士研究生学位论文 实验方法1.沙尘颗粒物采集 实验沙尘颗粒采集自内蒙古阿拉善高原和河西采样法，采样区附近没有大的障碍物、污染源，从现场收集后，过质（微生物材料，硫酸，硝酸盐，等有毒物质），制备实验用沙尘2.沙尘模拟 实验中应用改良型风洞（图 1），先将沙尘颗粒物注入采用高压压缩技术，形成高浓度沙尘云，经浓缩器底部进入实验仓调控沙尘颗粒物总浓度为 9000ug/m3，风速为 8m/s[23]。实验用参数PM 对大鼠肺组织病理学影响的研究及所获得的专利[24, 25]。

研究生学位论文 间经 t 检验，结果显示，p＜0.05，差异显著(图 4)。这大鼠肺脏发生较为严重的慢性炎症反应；5＇-氮杂胞苷去显降低。沙尘颗粒物诱导大鼠肺脏发生炎症反应、纤维基化起作用，表明 5＇-氮杂胞苷对沙尘诱导的肺纤维化用。

图 4 A 为沙尘组大鼠肺部 HE 染色（10x）:肺泡壁、肺间质内可见较多炎症细胞浸润，局部肺泡间隔增厚、肺泡结构破坏、紊乱，局部可见大量暗灰色沙尘颗粒物沉积。B 为非处理对照组大鼠肺脏 HE 染色（10x）：可见肺泡结构完整，肺泡壁光整，无增厚，无明显炎症细胞浸润。C 为沙尘干预组大鼠肺脏 HE 染色（10x）：可见大部分肺泡结构完整，局部肺泡结构破坏及少量沙尘颗粒物沉积区，炎症浸润范围与渗出物范围小、程度低。
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 雷丰丰;党雅梅;张正偲;刘华;陈其章;桑迎竹;;沙尘暴对大鼠肺组织影响的病理学观察[J];中华病理学杂志;2015年03期

2 张德平;;特发性肺纤维化合并肺癌[J];中华结核和呼吸杂志;2012年09期

3 贺蓉;邹德学;余振东;郭敛容;;鼻咽癌组织中细胞周期相关基因CDKN2B/p15的表达及临床意义[J];中国实验诊断学;2009年05期

本文编号：2839305