GLP-1受体在急性肺损伤中对肺血管内皮细胞的保护作用及机制探讨

发布时间：2020-10-21 23:56

　　 急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由多种致病因素引起的肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞受损,引起炎症细胞浸润,血浆蛋白渗出,肺间质和肺泡水肿,从而导致急性呼吸功能不全。病理生理表现为肺顺应性降低、通气/血流比例失调。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)为ARDS发病的病理损伤机制。ARDS发病率和死亡率都很高,目前临床上治疗措施除了控制原发病、呼吸支持、控制感染、加强护理外,无特效治疗药物。因此,有必要对ARDS机制进一步研究并寻找更为安全有效的治疗药物。胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)是肠道L细胞分泌的肽类激素。GLP-1受体(glucagon like peptide-1 receptor,GLP-1R)为GLP-1天然的靶点,分布于各个组织脏器,具有广泛的生物学作用。利拉鲁肽为GLP-1类似物,临床上常用于2型糖尿病的治疗,可以结合并激活GLP-1R。研究发现GLP-1R激活可以保护内皮细胞屏障功能、调节炎症反应,从而保护多个器官免受多种损伤因素导致的功能损害。考虑到GLP-1R的抗炎和内皮保护作用,激活GLP-1R可能有利于ARDS的治疗。因此,本研究第一部分,小鼠气道内滴注脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)建立ALI模型,研究利拉鲁肽激活GLP-1R对小鼠ALI的保护作用及相关机制。第二部分,将中性粒细胞和人肺微血管内皮细胞共培养,进一步探索利拉鲁肽激活GLP-1R对LPS诱导的人肺微血管内皮细胞功能的影响及其相关机制。第一部分GLP-1受体激活对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤保护作用目的:观察利拉鲁肽激活GLP-1R对LPS诱导的小鼠ALI保护作用及其机制。方法:40只C57BL/6小鼠随机分为5组:对照组、LPS组、LPS+利拉鲁肽(0.2、0.8 mg/kg)组、利拉鲁肽(0.8 mg/kg)单独给药组,每组8只。气道滴注LPS(15 mg/kg)建立小鼠ALI模型,并同时皮下注射利拉鲁肽。24小时后处死小鼠,收集外周血、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、肺组织。ELISA检测血清和BALF GLP-1含量,RT-qPCR检测肺组织GLP-1R、TLR4及MIF、IL-6、CXCL1、CXCL2 mRNA水平,Western blot检测GLP-1、TLR4及细胞间连接蛋白ZO-1、Occludin、VE-cadherin表达;HE染色和定量肺损伤评分评估肺组织病理损伤;免疫组化染色评估肺组织中性粒细胞浸润;细胞分类计数计算BALF内中性粒细胞和巨噬细胞数量;TUNEL检测细胞凋亡;伊文斯兰染料渗出实验和BALF蛋白含量测定评估肺血管通透性。结果:HE染色显示,LPS诱导小鼠肺泡弥漫性损伤,利拉鲁肽(0.2、0.8mg/kg)减轻LPS诱导肺部病理损伤程度。免疫组化显示,ALI小鼠肺组织大量Ly6G~+中性粒细胞浸润,利拉鲁肽(0.2、0.8mg/Kg)给药显著减少中性粒细胞浸润。BALF中细胞分类计数结果显示,利拉鲁肽(0.8mg/Kg)抑制LPS诱导的肺泡间隙中性粒细胞、巨噬细胞渗出。RT-qPCR结果显示,利拉鲁肽(0.2、0.8mg/kg)降低LPS诱导的炎症因子MIF、IL-6、CXCL1、CXCL2的mRNA表达。与对照组相比,LPS组小鼠伊文斯兰染料和蛋白渗出明显增多,利拉鲁肽(0.2、0.8mg/kg)显著减少其渗出。TUNEL染色结果显示,LPS诱导小鼠肺部凋亡细胞数量增多,利拉鲁肽(0.2、0.8mg/kg)给药显著减少LPS诱导的细胞凋亡。与对照组相比,LPS可使小鼠血清GLP-1水平降低,而BALF中GLP-1水平升高,肺组织GLP-1R、TLR-4 mRNA和GLP-1、TLR-4蛋白也因LPS刺激表达增加,利拉鲁肽抑制上述效应。Western blot结果显示,LPS刺激降低肺组织中VE-cadherin、ZO-1和Occludin蛋白表达,利拉鲁肽(0.8 mg/kg)给药恢复这些蛋白的表达。结论:激活GLP-1R,利拉鲁肽缓解LPS诱导的小鼠肺部病理损伤、减少炎症细胞浸润和相关炎症因子释放、降低肺毛细血管通透性、维持肺血管内皮屏障功能,从而减轻LPS诱导的小鼠ALI。第二部分GLP-1受体激活对人肺微血管内皮细胞功能的影响及其机制目的:探讨利拉鲁肽激活GLP-1R对培养的人肺微血管内皮细胞功能的影响及其机制。方法:培养人肺微血管内皮细胞,分为Control组、LPS组、LPS+利拉鲁肽(200、400、800nM)组、利拉鲁肽(800nM)单独给药组;RT-qPCR检测ZO-1、Occludin mRNA水平。免疫荧光和Western blot检测ZO-1、VE-cadherin表达。将中性粒细胞和经LPS刺激的人肺微血管内皮细胞共培养,RT-qPCR和Western blot检测细胞间粘附分子-1(cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1 adhesion molecule-1,VCAM-1)表达;免疫荧光法检测人肺微血管内皮细胞上中性粒细胞粘附情况。Transwell分析中性粒细胞跨内皮迁移。Western blot检测Rho-GTP蛋白和MYPT1、p65磷酸化水平。结果:利拉鲁肽抑制LPS诱导的人肺微血管内皮细胞ZO-1,Occludin mRNA和ZO-1、VE-cadherin蛋白表达的下调。免疫荧光染色结果显示,利拉鲁肽恢复细胞间连接VE-cadherin和ZO-1表达。共培养研究结果显示,利拉鲁肽抑制LPS诱导的人肺微血管内皮细胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1 mRNA及其蛋白表达,减少中性粒细胞向活化的人肺微血管内皮细胞粘附和跨内皮迁移;利拉鲁肽抑制LPS诱导的人肺微血管内皮细胞胞内Rho-GTP和磷酸化的MYPT1、p65蛋白表达。结论:GLP-1R激活有利于维持人肺微血管内皮细胞间连接,抑制人肺微血管内皮细胞黏附分子表达,减轻LPS诱导的人肺微血管内皮屏障功能障碍,减少中性粒细胞向内皮细胞粘附和跨内皮迁移。GLP-1R激活能够通过抑制Rho和NF-κB信号通路,从而减轻LPS诱导的人肺微血管内皮细胞功能障碍。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R563
【部分图文】：

图 1. GLP1-R 激活对 ALI 小鼠肺组织病理损伤影响。HE 染色观察肺组织损伤，定量肺损伤评分量化肺组织损伤情况。*P＜0.05。二、GLP-1R 激活对 ALI 小鼠肺部炎症细胞浸润的影响

图 2. GLP-1R 激活对 ALI 小鼠肺部炎症反应的影响。（A）免疫组化检测肺组织中性粒细胞浸润；（B）BALF 内中性粒细胞分类计数；（C）BALF内巨噬细胞分类计数；*P＜0.05 vs control，#P＜0.05 vs LPS 组。

GLP-1R 激活对 ALI 小鼠肺部炎症因子表达的影响。鼠肺组织中炎症因子，包括 MIF、IL-6、CXCL1、CXCL2 的表达。*P＜0.05GLP-1R 激活对 ALI 小鼠肺血管通透性的影响如图 4A 所示，与对照组相比，LPS 组肺组织明显变蓝，提示从血管
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本文编号：2850780