肺成纤维细胞表面Thy-1的表达和表观遗传药物影响下的增殖和分化

发布时间：2020-10-31 02:01

　　 一、IPF和非IPF患者肺成纤维细胞表面Thy-1的表达及在TGF-β刺激下的表达差异 目的:建立肺成纤维细胞的培养方法,为肺纤维化的发病机制和治疗措施体外研究提供细胞技术平台;探索IPF和非IPF患者肺成纤维细胞株的亚群差异。 方法:采用肺组织块接种培养法,培养的细胞通过相差显微镜和透射电镜观察形态、免疫细胞化学染色检测细胞表型标记蛋白等进行鉴定,流式细胞术检测各种情况下表面Thy-1的阳性率,并用流式分选系统(FACS)分选出Thy-1(-)细胞。 结果:培养的IPF患者成纤维细胞株细胞呈梭形,单个核,多突起,有伪足,边缘清晰整齐,贴壁生长,表达波形蛋白(vimentin)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA),不表达角蛋白(cytokeratin)和结蛋白(desmin)。电镜观察到胞质中有丝状a-SMA纤维。IPF成纤维细胞株的表面抗原Thy-1阳性率明显低于正常成纤维细胞株,并分成明显的Thy-1阳性和阴性两个亚群。TGF-β刺激后IPF成纤维细胞株的Thy-1的阳性率降低比正常细胞株明显。 结论:原代培养的IPF患者成纤维细胞株细胞含有肌成纤维细胞(MyoF)并且可以传代,可分选出Thy(-)细胞,为后续实验提供了基础。成纤维细胞表面抗原Thy-1的阳性率在纤维化肺组织和正常肺组织是有显著差异的,经TGF-β刺激后其差异更加明显。 二、表观遗传药物5-氮杂胞苷、丙戊酸钠对肺成纤维细胞增殖及分化的影响 目的:探索表观遗传药物对IPF患者肺成纤维细胞株的干预影响,以期为肺纤维化的治疗提供一个新的选择。 方法:用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷和组蛋白乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠处理IPF患者肺成纤维细胞株,地塞米松为对照。用噻唑兰MTT细胞增殖实验定量检测细胞株的增殖和药物的细胞毒性情况。分别应用流式细胞技术、免疫细胞化学法观察各药刺激前后该细胞株表面Thy-1表达的变化和细胞平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达差异。 结果:IPF患者肺成纤维细胞株在DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷处理24小时后可明显抑制增殖,5μmol/l作用48小时后表面抗原Thy-1的阳性率上升为93.7%±1.95%,5μmol/l处理5天后α-SMA的阳性率下降为49.2%±6.4%(p＜0.05)。在丙戊酸钠处理24小时后显著抑制增殖,10 mg/ml作用48小时后表面抗原Thy-1的阳性率上升为95.5%±2.21%,10 mg/ml处理5天后α-SMA的阳性率下降为36.6%±6.9%(p＜0.05)。地塞米松虽然可明显抑制IPF患者肺成纤维细胞株的增殖,5μmol/l剂量作用24小时后表面抗原Thy-1的阳性率上升为87.7%±1.46%,但在5μmol/l剂量作用5天后α-SMA的阳性率为86.3%±4.9%(p＞0.05)。 结论:表观遗传药物DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷和组蛋白乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠能够抑制IPF患者肺成纤维细胞株的增殖,在相应的亚细胞毒性剂量上可导致细胞表面抗原Thy-1的表观上调,使肌成纤维细胞的特征标记物平滑肌肌动蛋白α-SMA表达降低。在肺纤维化的治疗中具有应用前景。
【学位单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R563
【文章目录】：
目录
缩略语
实验流程图
中文摘要
Abstract
第一部分 IPF和非IPF患者肺成纤维细胞表面Thy-1的表达及在TGF-β刺激下的表达差异
    前言
    实验对象和材料
        一、肺组织来源
        二、细胞因子TGF-β
        三、主要耗材
        四、主要试剂
        五、主要仪器
    实验方法
        一、人肺成纤维细胞原代培养
        二、成纤维细胞的鉴定
        三、流式细胞术（FCM）
        四、流式分选术（FACS）
    结果
        一、成纤维细胞的鉴定
        二、IPF和非IPF患者肺成纤维细胞表面Thy-1的表达和在TGF-β刺激下表面Thy-1的表达差异
        三、IPF患者肺成纤维细胞分选
    讨论
    小结
    参考文献
第二部分 表观遗传药物5-氮杂胞苷、丙戊酸钠对肺成纤维细胞增殖及分化的影响
    前言
    实验材料
        一、细胞来源及细胞培养
        二、表观遗传药物5-氮杂胞苷、丙戊酸钠以及地塞米松
        三、主要耗材
        四、主要试剂及试剂盒
        五、主要仪器
    实验方法
        一、细胞增殖试验（MTT试验）
        二、流式细胞术（FCM）
        三、免疫细胞化学法
        四、统计学处理
    结果
        一、表观遗传药物和激素刺激前后IPF患者肺成纤维细胞株的增殖情况
        二、表观遗传药物和激素刺激前后IPF患者肺成纤维细胞株表面Thy-1的表达差异
        三、表观遗传药物和激素刺激前后IPF患者肺成纤维细胞株α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达差异
    讨论
    小结
    参考文献
综述 Thy-1——影响肺纤维化发展的成纤维细胞亚群的特征标记分子
附录 主要溶液的配制
致谢

【共引文献】

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本文编号：2863301