Toll样受体在慢性阻塞性肺疾病发病机制中的作用

发布时间：2020-11-03 08:54

　　 背景和目的 Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)可特异性识别多种病原成份,启动固有免疫反应,并进一步诱导适应性免疫应答。呼吸道感染及环境暴露因素对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发生、发展有重要影响。作为固有免疫的重要组成部分,TLRs是连接环境暴露与适应性免疫的重要桥梁,其在COPD发病机制中发挥的作用开始受到广泛关注。现有研究结果提示TLRs参与COPD的病理过程和免疫应答,但对TLRs在COPD患者体内实际表达情况和作用的研究很少。本课题在稳定期COPD患者中,以健康不吸烟者、肺功能正常吸烟者、慢性持续期支气管哮喘(简称哮喘)为对照,探讨TLRs在COPD发生发展及炎症特点中的作用;应用A549肺上皮肿瘤细胞株,探讨Th1相关细胞因子及糖皮质激素治疗对呼吸道上皮TLRs表达的调节,从而进一步明确TLRs在COPD发病机制中发挥的作用。 研究对象、方法 临床研究部分 入选健康不吸烟者25例,肺功能正常吸烟者21例,稳定期COPD患者30例,慢性持续期哮喘患者30例。其中稳定期COPD患者均为吸烟者。应用流式细胞仪全血免疫荧光直标法检测所有受试者外周静脉血CD14+单核细胞及中性粒细胞的TLR2、TLR4表达。所有受试者均检测肺功能,COPD患行查痰培养、血清C反应蛋白(CRP),应用酶连免疫吸附法(ELISA)测定COPD和哮喘患者血清TNF-α、IL-8浓度。 实验室研究部分 以A549人肺上皮肿瘤细胞株为实验对象,分别单独应用Th1相关细胞因子IFN-γ及TNF-α、地塞米松或联合应用地塞米松及上述细胞因子处理细胞,采用实时定量聚合酶链式反应(Real time PCR)法检测A549细胞TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6表达的变化情况。 研究结果 临床研究部分 1.CD14+单核细胞TLR2表达强度及阳性细胞率显著高于中性粒细胞(P＜0.001)。CD14+单核细胞TLR2表达与TLR4表达成正相关(P＜0.001)。CD14+单核细胞与中性粒细胞间TLR2、TLR4表达成正相关(P＜0.05)。 2.COPD患者有24例留取合格痰标本,其中16例细菌负荷量超过10~5CFU/ml,以革兰氏阴性杆菌为主;CRP均处于正常水平。 3.健康不吸烟者、肺功能正常吸烟者及稳定期COPD患者3组比较: a.外周血CD14+单核细胞TLR2和TLR4的表达在肺功能正常吸烟者中明显下调(P＜0.05),在稳定期COPD患者中进一步显著下降(P＜0.05)。 b.外周血中性粒细胞TLR2表达在肺功能正常吸烟者中明显下调(P＜0.05),在稳定期COPD患者中有进一步下降趋势(P＞0.05)。中性粒细胞TLR4表达情况3组间无明显差异(P＞0.05)。 c.CD14+单核细胞TLR2和TLR4的表达强度,中性粒细胞TLR2的表达强度与FEV_1%预计值、FEV_1/FVC比值成显著正相关(P＜0.001)。 4.慢性持续期哮喘患者CD14+单核细胞中TLR2及TLR4阳性细胞率明显高于健康对照组(P＜0.01),中性粒细胞TLR2、TLR4的表达低于健康对照(P＜0.01)。CD14+单核细胞TLR2和TLR4的表达强度与哮喘患者血清IgE浓度有相关的趋势。 5.COPD患者与哮喘患者的比较: a.COPD患者外周血中性粒细胞TLR2、TLR4表达明显高于哮喘患者(P＜0.05) b.COPD患者CD14+单核细胞TLR2、TLR4表达强度及阳性细胞率显著低于哮喘患者(P＜0.001)。 c.COPD患者血清IL-8浓度水平显著高于哮喘患者,血清TNF-α浓度水平则低于哮喘患者(P＜0.01)。 d.外周血中性粒细胞TLR2及TLR4表达强度与血清IL-8浓度成正相关(P＜0.01),单核细胞TLR2及TLR4阳性细胞率与血清TNF-α浓度成正相关(P＜0.01)。 实验室研究部分 1.IFN-γ使A549细胞TLR3表达明显上调,达对照组的3.78倍(P＜0.05)。 2.TNF-α使A549细胞TLR2、TLR6出现轻度上调(P＜0.05),分别达到对照的1.62倍和1.22倍。 3.地塞米松使A549细胞TLR2、TLR4表达明显上调,分别达对照的3.27及3.43倍(P＜0.05)。 4.地塞米松与IFN-γ共同作用A549细胞时,TLR2表达显著上调,达对照的6.25倍,地塞米松与TNF-α联合作用时TLR2表达增加至对照6.09倍(P＜0.05)。 5.TNF-α与IFN-γ联合刺激A549细胞时,TLR2上调达对照的3.66倍,而地塞米松与TNF-α、IFN-γ三者共同作用A549细胞时,TLR2的表达出现十分显著的上调,达对照的29.81倍(P＜0.05)。 结论 1.健康人群单核细胞TLR2、TLR4表达显著高于中性粒细胞。 2.吸烟抑制单核细胞和中性粒细胞TLRs表达。 3.COPD患者单核细胞和中性粒细胞TLRs表达受到抑制,TLRs表达下调与病情进展有关。 4.COPD患者TLRs的表达状态与其炎症反应特点有关。 5.Th1细胞因子及糖皮质激素上调呼吸道上皮细胞TLRs表达,二者对呼吸道上皮细胞TLR2表达的上调具有协同作用,提示吸入激素治疗可能增强COPD患者气道上皮防御功能。
【学位单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R563.9
【部分图文】：

离心分离血清，分装后保存于一80℃冰箱。(二)流式细胞检测1.样本处理采新鲜血样后4小时内处理。取EDTA抗凝全血300协L，分装3管。每CD14一FITc单抗(6lD3，10林创inl)。试验管分别加抗TLRZ一pE(TLZ.l，10和抗TLR4一PE(H认一25，10林g/]间);对照管加同型对照IgG2a(lo林创回)，光孵育30分钟。每管加溶红素1而，震荡器充分混匀，避光室温孵育10分心弃上清，PBs洗涤2次，重悬于1%多聚甲醛固定液200匹中，应用FACSc流式细胞仪获取细胞，每管样本至少获取5000个目标细胞。2.细胞获取单核细胞:用FSC/SSC设定单核细胞门Rl，根据CD14表达情况画出阳性门R2，从Rl及R2门的交集即CD14+单核细胞中获取TLRS抗体染色阳胞。见图1。宕O一8.

北京协和医学院中国医学科学院博十研究生学位论文中性粒细胞:用FSC/SSC设定粒细胞门RI，从中获取TLRs抗体染色阳性细胞。见图2，，·八价R’ ’义 义一必、 /// ...二戒半夯一扩 扩 ....二’:·、.:扛丁少二 二挤挤沪一 一00口00寸兰一幼.不公55FSC一e一ght图2中性粒细胞流式检测设门图3.CellQuest软件数据分析根据同型对照获取情况设定获取条件，使协样本获取时均处于相近条件卜。根据同型对照位置设定阴性细胞区Ml及阳性细胞区MZ，记录TLRs表达平均荧光强度(mfi)及TLRS阳性细胞率。见图3。0000007060闷 01999999999999999999。07060闷 0200000000000007060闷 .0211111111111:::日甄万 {一 一:日荻范二 {加 加、兄)石率 }翩 翩甘甘1.司司 司 司奋刁 11LJ~11气 气气…匕裁嗽‘二二二ee，~.二二二翻山抽抽心.曰 曰八八八O‘L一一一--二盏-.一一.一JJJ0勺 1匕毛l飞一一 一一 UUIU已 EEEEUIU IIIIIUIU!U{UIUUUUU._〕八一 }}}}}}}}}}}}}}}}几 R4PEEEE喃喃喃喃喃 useeIgGZaaPEEEEEEEEE。戈咐挽叹呼叮州 ;;;;;;;;;{{{{{o

4阳性细胞率较高(P<0.OS)。见表1，图1。表1CD14+单核细胞及中性粒细胞TLRZ、TLR4表达情况TLRZm五TLRZ耳沁P(o/.)TLR4m6几R4耳姆P(，/o)14+M11.以士2.4382.7狂l7.9()PM入2.21士0.5222.10士16.751.99士0329.!6士6.40计值尸值17.7712.388.502一2.0910.以K)0.(XX)0.《以】0.042为TLRs相对平均荧光强度，rpCp为TLRS阳性细胞相对百分率，M代表单核中性粒细胞。100.的
【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 邓鸿杰;COPD患者外周血单个核细胞TLR4表达及血清GRP检测的临床意义[D];川北医学院;2012年

本文编号：2868364