IκBα突变体靶向抑制NF-κB对哮喘血清-内皮穿越模型中树突状细胞分化的影响的研究

发布时间：2020-11-11 07:41

　　 IκBα突变体靶向抑制NF-κB对哮喘血清-内皮穿越模型中树突状细胞分化的研究 树突状细胞(dendritic cell,DC)作为体内已知功能最强的抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC),在免疫激活以及免疫耐受中发挥重要作用。“Th1/Th2偏移”假说是哮喘发病的主要免疫学机制,近期研究认为哮喘是机体对变应原的“免疫耐受”机制异常和/或缺陷而导致体内Th1/Th2偏移。而DC的类型、成熟状态以及局部微环境在决定Th0细胞向调节性T细胞或效应性T细胞分化中起着关键作用。DC分化发育成熟依赖于核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)激活。利用未成熟DC诱导T细胞耐受在许多免疫性疾病中得到了应用,但用于哮喘预防和治疗的成功报道还很少。因人外周血DC数目有限,目前对DC的研究往往依赖于体外诱导培养体系如GM-CSF和IL-4诱导体系,但实际上在体内很难出现如此高水平的细胞因子内环境。最近,权威杂志Science相继报道了模拟正常人单核细胞在体内迁移分化发育成DC的内皮细胞穿越模型和正常人单核细胞在系统性红斑狼疮患者血清中2～3天分化为DC的研究。因此,本课题首先构建内皮细胞穿越模型,研究正常人外周血CD14+单核细胞是否能在正常人血清和哮喘患者血清中通过此模型分化为DC,并比较单核细胞在正常血清和哮喘血清条件下分化的DC表型、功能的差异;然后以不易降解的新颖NF-κB超强抑制剂(AdIκBαM)转染正常人外周血单核细胞,利用哮喘患者血清诱导该单核细胞在内皮细胞单层中发生逆穿越,观察AdIκBαM靶向抑制NF-κB是否影响单核细胞在哮喘血清-内皮穿越模型中分化为DC,并进一步探讨其对分化细胞的表型和功能的影响。 第一部分支气管哮喘血清对单核细胞内皮(逆)穿越分化的树突状细胞表型及功能的影响 目的利用内皮穿越模型研究支气管哮喘患者血清对正常人单核细胞分化而来的DC表型及功能的影响。方法分离、培养脐静脉内皮细胞,分别以20%正常人血清(正常血清组)和哮喘患者血清(哮喘血清组)培养基重悬正常人外周血CD14+单核细胞,加入内皮细胞单层上,48 h后收集逆穿越内皮的细胞。同时以新鲜分离单核细胞和培养48 h单核细胞为对照。Giemsa染色及光学显微镜观察细胞形态;流式细胞术(FCM)检测细胞表型;混合淋巴细胞反应(MLR)检测细胞刺激同源异体CD4+ T细胞增殖的能力;ELISA法测定细胞培养上清液中IL-12 p70、IL-10水平;Western-blot检测细胞胞浆IκBα和NF-κB p65表达。结果正常血清和哮喘血清均可诱导正常人单核细胞在内皮穿越模型中逆穿越分化为树枝样突起的细胞(endothelial-associated dendritic cell,eDC),其表面单核细胞标志CD14表达显著下降,而共刺激分子CD80、CD86表达增高。与正常血清组相比,哮喘血清组eDC表面CD80、CD83表达明显增高(分别P0.05、P0.01),而CD86、HLA-DR的表达及刺激T淋巴细胞增殖的能力无显著差异(P均0.05)。哮喘血清组eDC培养上清中IL-12 p70、IL-10分泌均高于正常人血清组(分别P0.05、P0.01)。另外,Western-blot检测发现,与正常血清组比较,哮喘血清组细胞胞浆pIκBα表达增加,而NF-κB p65表达降低。结论正常人单核细胞在正常血清和哮喘血清均可逆穿越内皮分化为eDC样细胞,哮喘患者血清则进一步通过部分上调eDC表面分子的表达、促使其分泌IL-10、IL-12p70而诱导eDC的成熟。 第二部分IκBα突变体靶向抑制NF-κB对哮喘血清-内皮穿越模型中树突状细胞分化的影响 目的观察IκBα突变体转染对正常人CD14+单核细胞在哮喘血清-内皮穿越模型中DC分化及其功能的影响。方法分离、培养脐静脉内皮细胞。正常人CD14+单核细胞分为3组:未转染组、AdLacZ(β-半乳糖苷酶)转染组和AdIκBαM转染组。20%哮喘患者血清重悬单核细胞,加入内皮细胞单层上,48 h后收集逆穿越细胞。⑴Western-blot法检测逆穿越细胞胞浆中IκBα、IκBαM的表达;Giemsa染色及光学显微镜观察细胞形态;流式细胞术(FCM)检测细胞表面分子CD14、CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表达;酶联免疫法( ELISA)分析细胞培养上清中IL-12 p70和IL-10的水平;混合淋巴细胞反应(MLR)分析细胞刺激同种异体CD4+ T淋巴细胞增殖的能力;免疫荧光技术及电泳迁移率试验(EMSA)检测细胞中NF-κB活性。⑵逆穿越细胞经室尘螨变应原(Der p 1)刺激后,与同种异体CD4+ T淋巴细胞共培养72 h。ELISA方法测定培养液中IL-4和IFN-γ水平;Western-blot方法测定T淋巴细胞中T-bet、GATA-3及逆穿越细胞(eDC)中STAT6、pSTAT6表达水平。结果⑴Western-blot检测发现AdIκBαM转染单核细胞逆穿越分化而来的细胞胞浆中出现突变型(外源性) IκBαM基因,该细胞仍表现为树枝样突起,与未转染单核细胞分化而来的细胞一样低表达单核细胞标志CD14。而其表面分子CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达、IL-12 p70的分泌及刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力均显著低于未转染组和AdLacZ转染组分化细胞( P均 0.05),且AdIκBαM转染组分化细胞的NF-κB p65核表达阳性率和NF-κB DNA结合灰度值较未转染组和AdLacZ转染组显著降低( P均 0.05)。⑵未转染组和AdLacZ转染组分化细胞经Der p 1刺激后诱导CD4+ T淋巴细胞产生IL-4和IFN-γ,以IFN-γ显著升高(P 0.01),而AdIκBαM组分化细胞抑制T淋巴细胞产生IL-4和IFN-γ,伴随着T淋巴细胞中T-bet、GATA-3及eDC中pSTAT6表达降低。结论⑴AdIκBαM转染单核细胞可经内皮穿越分化为未成熟eDC样细胞。⑵AdIκBαM转染单核细胞来源的eDC在接触变应原后仍保持未成熟状态,并且可能通过抑制eDC中IL-12 p70分泌和STAT6激活而抑制T-bet、GATA-3表达,而阻止T淋巴细胞向Th1/Th2分化。 第三部分过表达IκBα突变体的树突状细胞对哮喘CD4+CD25+调节性T细胞作用的研究 目的探讨哮喘患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞数目与功能的变化及过表达IκBα突变体单核细胞来源的eDC对哮喘患者外周静脉血中调节性T细胞的影响。方法⑴流式细胞术(FCM)检测哮喘组和正常对照组外周静脉血中CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+ T细胞的百分比;分离CD4+CD25+调节性T细胞,与CD4+ T细胞、室尘螨变应原(Der p 1)共培养72 h,四唑盐比色(MTT)法检测CD4+ T细胞增殖。⑵分离、培养脐静脉内皮细胞。正常人CD14+单核细胞分为:未转染组、AdLacZ转染组和AdIκBαM转染组。用20 %哮喘患者血清重悬单核细胞,加入内皮细胞单层上,48 h后收集的逆穿越细胞与哮喘患者外周血中CD4+CD25- T细胞及室尘螨变应原(Der p 1)共培养72 h,流式细胞术(FCM)检测CD4+ T细胞中CD4+CD25+调节性T细胞百分比,酶联免疫法(ELISA)检测上清液中IL-10及TGF-β1含量。结果⑴哮喘组外周血中CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+ T细胞百分比低于正常对照组(P0.05);CD4+CD25+调节性T细胞能抑制哮喘CD4+ T细胞增殖,而哮喘组与正常组CD4+CD25+调节性T细胞抑制CD4+ T细胞增殖的能力无显著差异(P均0.05)。⑵与未转染组eDC和AdLacZ组eDC相比,过表达IκBα突变体的eDC能诱导哮喘患者CD4+CD25- T细胞向CD4+CD25+调节性T细胞极化并分泌IL-10 (P均 0.05)。结论⑴CD4+CD25+调节性T细胞数目减少可能是导致哮喘患者免疫失调的重要原因。⑵过表达IκBαM基因的eDC在体外能促进哮喘CD4+CD25+调节性T细胞的分化,增加抑制性细胞因子IL-10的分泌。提示DC在诱导T淋巴细胞对过敏原的免疫耐受过程中起十分重要的作用。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R562.25
【部分图文】：

经典激活途径：IκB激酶(IKK)诱导IκBα N端丝氨酸32/36磷酸化/p65二聚体入核。B，旁路激活途径：NF-κB诱导激酶(NIK)诱导I活化, 从而导致p100发生磷酸化依赖性剪切, 生成有活性的p52:并进入细胞核与靶基因结合, 调节基因的表达。图 2 NF-κB 的经典和旁路激活途径Ser32 Ser36DRHDSGLDS MKD×MV S plice + PolyAIκBαM cDNA以编码蛋氨酸（M，203-205 bp）的 ATG 作为起始密码，定点克隆的 IκBαM 基因（203-1003 bp），正好去除了其上游的 Ser32 和 Se化位点，推导的新颖 IκBαM 蛋白分子量为 30 kDa。

倒置显微镜下见：脐静脉内皮细胞呈铺路石样镶嵌排列的胞为扁平多角形(×100)；B，间接免疫荧光染色：细胞核周围胞绿色荧光(选自 6 次实验中的 1 次)。图 1.1 脐静脉内皮细胞的鉴定35

未穿越单核细胞逆穿越细胞A，倒置显微镜观察，未穿越单核细胞表面光滑，而逆穿越细胞表面有毛刺状突起；B：Giemsa 染色：未穿越单核细胞表面平滑，而逆穿越细胞表面有毛刺状突起(×400)。(选自 6 次实验中的 1 次)。图 1.2 单核细胞源 eDC 的形态36
【参考文献】

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1 张明顺;张江全;王慧娟;柯瑶;刘衍春;季晓辉;李玉峰;;内皮细胞穿越模型中系统性红斑狼疮患者树突状细胞分化及功能状态的初步研究[J];中华风湿病学杂志;2006年01期

2 ;Effects of adenoviral gene transfer of mutated IκBα,a novel inhibitor of NF-κB,on human monocyte-derived dendritic cells[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年05期

3 覃寿明;施焕中;覃雪军;陈一强;钟小宁;;支气管哮喘患者外周血中的CD_4~+CD_(25)~+T淋巴细胞的测定[J];中华结核和呼吸杂志;2006年04期

本文编号：2878931