早期接种卡介苗对哮喘小鼠IL-10和VCAM-1表达影响的研究

发布时间：2020-11-21 13:10

　　 研究背景 在过去的数十年内，哮喘在世界范围内发病人数有一定的上升，尤其是高收入国家。人类对支气管哮喘的发病机理有了更深入的认识，哮喘治疗手段也日益增多，但哮喘的发病率和死亡率并没有明显下降。相反，在许多国家哮喘的发病率和死亡率不降反升，成为人类健康的严重威胁。 近年来研究表明，辅助性T细胞(Th)Th1/Th2功能失衡，Th2活化亢进在哮喘发病机制中起重要作用。哮喘患者体内Th0向Th2分化过度，Th2细胞产生多种细胞因子如IL-4、IL-5及IL-13等促进过敏原特异性IgE的合成，介导骨髓嗜酸性粒细胞分化、成熟及向肺组织趋化，促进气道黏液分泌和气道高反应性，从而导致哮喘的发生。卡介苗(BCG)是结核分支杆菌减毒活疫苗，是一种很强的Th1免疫反应刺激剂，能纠正Th1/Th2失衡。目前为止，以动物进行的研究均显示BCG接种能明显抑制OVA致敏和激发所致的气道嗜酸性粒细胞浸润，降低气道高反应性以及Th2型细胞因子的表达。 白介素-10(IL-10)是炎症抑制因子，由Th2细胞、树突状细胞、巨噬细胞、调节性T细胞等分泌。DC等细胞分泌的IL-10，诱发调节性T细胞-1(Tr1)进一步分泌IL-10，大量的IL-10可抑制Th2细胞，从而抑制哮喘和过敏性疾病，IL-10对哮喘和过敏性疾病的作用机制仍不明确，IL-10各种研究资料结果差异很大，哮喘患者BALF和血中的IL-10上升和下降的表达都有报道。IL-10对IL-1、IL-4、IL-12、TNFα、NF-κB等多种炎症因子具有抑制作用，从而间接抑制哮喘患者的肺组织EOS炎症和气道高反应性等，合成IL-10代表机体的保护性调节。 哮喘患者的肺组织EOS炎症，是呼吸道变应性炎症的一个重要特征。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，作为特异性地介导嗜酸粒细胞浸润到肺组织的粘附分子，在哮喘中可能扮演了重要的角色。VCAM-1除了引起EOS的粘附作用，可能还具有共刺激分子作用，参加机体的免疫调节。VCAM-1是粘附分子的一员，是一类调节细胞与细胞之间相互粘附、相互作用的膜表面糖蛋白，主要表达在活化内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞上。VCAM-1的基因表达主要由转录因子NF-κB控制。各种致炎因子，如IL-1、IL-4、IL-12、TNFα和IFN-γ等诱导VCAM-1的表达。由于IL-10对IL-4、TNFα、NF-κB等多种炎症因子具有抑制作用，IL-10可能通过广泛地抑制炎症因子，间接对VCAM-1等粘附分子起一定的作用。 本次课题设计，通过观察IL-10和VCAM-1的表达，探讨卡介苗对哮喘治疗的作用机制，为哮喘的实验理论研究提供支持。 研究目的 本研究给予初生幼鼠早期多次小剂量BCG接种，观察预防哮喘的长期(25周)效果。在此过程中，通过观察IL-10、VCAM-1在小鼠支气管肺泡灌洗液、肺组织中的表达，探讨BCG预防哮喘的机制。 研究方法 C57BL/6小鼠分为NS/NS(对照组)、NS/OVA组(模型组)和BCG10~5/OVA组、BCG10~(5-3)/OVA组。小鼠出生0、7、14天子减毒活疫苗BCG皮内注射接种，第5周、第7周2次卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏，25周3次雾化激发建立哮喘模型。最后一次抗原激发48h后收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，肺组织石蜡包埋和冰冻保存。肺组织HE染色，观察哮喘模型是否成功。RT-PCR方法测定肺组织VCAM-1和IL-10的mRNA水平，ELISA方法测定BALF的IL-10水平，肺组织石蜡切片免疫组化方法观察VCAM-1的表达情况。 研究结果 1．气道炎症变化 肺组织病理切片HE染色显示，抗原激发48h后模型组肺组织EOS和炎症细胞浸润与对照组相比明显增多(n=6，P＜0.05)，BCG10~5/OVA和BCG10~(5-3)/OVA肺组织EOS和炎症细胞浸润与模型组相比减少(n=6，P＜0.05)。 2．RT-PCR检测肺组织IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA的水平 模型组、BCG10~5/OVA组、BCG10~(5-3)/OVA组的IL-10 mRNA表达与对照组相比均明显增加，差异有显著性(n=6，p＜0.05)。而VCAM-1 mRNA各组与对照组间比较并无明显差异(n=6，p＞0.05)。 3．ELISA检测BALF中IL-10蛋白表达的水平 BCG10~5/OVA组IL-10水平与模型组、OVA+BCG10~(5-3)组相比有显著升高(n=6，p＜0.05)，模型组、BCG10~(5-3)/OVA组与对照组相比有下降，但无显著性差异(n=6，p＞0.05)。 4．免疫组化检测肺组织中VCAM-1蛋白表达的水平 肺组织病理切片免疫组化染色显示，VCAM-1主要表达于支气管粘膜气道上皮、支气管平滑肌、血管内皮、血管周围淋巴等细胞胞浆中。气道上皮细胞哮喘模型组、BCG10~5/OVA组、BCG10~(5-3)/OVA组均呈不同程度的阳性(深棕黄色到浅棕黄色不等)表达，而对照组中呈弱阳性(浅棕黄色)表达。用秩和检验，四组样本总体有显著差异性，P＜0.05。样本两两比较显示，BCG10~5/OVA组与对照组、模型组、BCG10~(5-3)/OVA组比较有显著性差异(n=6，p＜0.05)。 结论 1．小鼠生命早期接种BCG，预防哮喘有长期(25周)作用，同时与BCG接种的剂量大小有关。 2．IL-10对哮喘起保护性调节作用，可能与APC的免疫调节、Treg的激活、Th2细胞的抑制等有关。 3．BCG治疗后VCAM-1表达的升高，可能对哮喘小鼠免疫调节起一定的作用。VCAM-1在哮喘的发生中可能有复杂的作用，一方面参与了哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞炎症浸润的病理过程，另一方面可能作为协同刺激信号激活CD4~+T细胞，起免疫监督作用。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R562.25
【部分图文】：

匆加;’’砍驴2007“硕士学位论文图2一1:对照组:气道上皮完整，纤毛排列整齐，杯状细胞少见，基底层以及平滑肌层较薄，肺小血管内皮光滑，血管、气道周围见极少量的炎症细胞，以巨噬细胞为主，未见到嗜酸性粒细胞。(HE染色，SPX巧0)图2一2:模型组:气道上皮细胞增生肥大，上皮不完整，纤毛排列紊乱，上皮下基底层增厚，平滑肌肥大增生，气道和血管周围、肺泡隔内见大量嗜酸性粒细胞浸润。(HE染色， SPx150)

平滑肌层较薄，肺小血管内皮光滑，血管、气道周围见极少量的炎症细胞，以巨噬细胞为主，未见到嗜酸性粒细胞。(HE染色，SPX巧0)图2一2:模型组:气道上皮细胞增生肥大，上皮不完整，纤毛排列紊乱，上皮下基底层增厚，平滑肌肥大增生，气道和血管周围、肺泡隔内见大量嗜酸性粒细胞浸润。(HE染色， SPx150)

匆沁介认掌2007“硕士学位论文图2一3:BCGIOS/ovA组:气道上皮略增生肥大，上皮相对完整，纤毛排列较紊乱，杯状细胞可见，上皮下基底层以及平滑肌层略增厚，血管、气道周围可见少量嗜酸性粒细胞。(HE染色，SPX一50)图2一4:BCG105一3/OVA组:气道上皮细胞略增生肥大，上皮相对完整，纤毛排列较紊乱，杯状细胞可见，上皮下基底层略增厚，平滑肌略肥大增生，气道和血管周围、肺泡隔可见少量嗜酸性粒细胞浸润。(HE染色， SPx150)
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本文编号：2893048