组织因子途径抑制物-2相互作用蛋白的筛选及在急性肺损伤中的作用

发布时间：2020-11-21 22:40

　　 组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)又称胎盘蛋白—5(placenta protein-5,PP-5)和基质相关丝氨酸蛋白酶抑制剂(matrix associated serine protease inhibitor,MSPI),是一种带有kunitz型结构域的蛋白酶抑制剂,属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员。成熟的人TFPI-2由富含酸性氨基酸的N端、三个串联的kuntiz结构域和富含碱性氨基酸的C端组成,能抑制胰蛋白酶、纤溶酶、糜蛋白酶、血浆缓激肽释放酶、组织蛋白酶G和多种基质金属蛋白酶(MMPs)的活性,从而对抗多种恶性肿瘤的侵袭转移。TFPI-2与同家族的组织因子途径抑制物-1(TFPI-1)结构相似,功能部分相同,也是一种重要的抗凝物质,对凝血因子Ⅶa(FⅦa)/组织因子(tissuefactor,TF)复合物、凝血因子Xa(FXa)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿型纤溶酶原激活物(uPA)等均有不同的抑制作用。但迄今为止,TFPI-2的生理功能尚不清楚,TFPI-2与其它蛋白质相互作用的信息也知之有限。 我们运用Matchmaker酵母双杂交系统3,构建了pGBKT7/TFPI-2质粒载体。以此质粒为诱饵,从人胎脑cDNA文库中筛选出了95个蛋白编码基因,包括32个代谢相关基因(其中8个参与蛋白代谢,13个参与核酸代谢,11个参与糖代谢),21个信号传导相关基因,5个细胞生长与生存相关基因,7个运输相关基因,2个抗调亡相关基因,其余28个基因的功能不明确。通过分析相关蛋白的细胞定位、已知功能及文库载体在双杂交系统中正确表达的可能性等,进一步确定了8个可能与TFPI-2有潜在相互作用的蛋白。 除筛选与TFPI-2相互作用的蛋白质外,我们对TFPI-2在急性肺损伤(acutelung injury,ALI)中的作用甚感兴趣。ALI是机体遭受严重感染、创伤、输血、休克、酸中毒及有害气体吸入等多种因素打击后,出现弥漫性肺泡—毛细血管膜损伤,以广泛渗出性肺水肿和微小肺不张等为病理特征的临床综合征。ALI病因复杂,起病急骤,发病持续,存在从轻到重的连续病变过程。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)属重症ALI,是临床上常见的危重性疾病。由于ALI发病机制不甚明确,迄今缺乏有效的治疗策略和手段,死亡率一直居高不下,病死率高达40-60%。 急性炎症级联反应是最早发现的ALI病理变化,贯穿于ALI始终,解释了ALI的多种病理现象。近年来,凝血机制倍受关注,研究发现ALI许多病理变化与凝血异常相关,如血栓形成、纤维蛋白沉积、出血和弥漫性血管内凝血(DIC)等,甚至有人提出ALI特征性病理变化—透明膜的形成也与凝血异常有关。 既往研究表明,在ALI发生过程中,肺组织中许多促凝因子表达明显升高,如组织因子(TF)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)等;而抗凝因子的表达降低或无明显变化,如TFPI-1。但TFPI-2在ALI中的变化及作用未见报道。因此,我们观察了TFPI-2在小鼠ALI发生和发展过程中的动态变化及与肺组织中凝血因子和炎症因子之间的关系。 我们采用尾静脉注射内毒素法成功建立了小鼠ALI动物模型。病理形态学检测显示,ALI小鼠肺组织在内毒素处理后的不同时间里,出现了明显的毛细血管充血、炎性细胞侵润、肺泡水肿、血栓形成、纤维蛋白在肺泡壁及间质沉积、透明膜形成、肺组织实变、出血和DIC等一系列炎症级联和凝血异常的病理变化。我们应用实时定量PCR和免疫组化方法测定了ALI小鼠肺组织中的TFPI-2、TFPI-1、TF和炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平。发现TFPI-2在ALI小鼠肺组织中明显升高,其变化呈现时间依从性,在内毒素处理后2h达到高峰,随后逐渐下降,12h时基本恢复到初始水平。TFPI-2的动态变化模式与重要炎症因子IL-1β和TNF-α的动态表达模式相似,且两两之间呈明显正相关,TFPI-2在ALI中随IL-1β和TNF-α的变化而变化。此外,我们发现TF在内毒素处理6h后开始上升,12h达到高峰;而TFPI-1在内毒素处理的初期即呈下降趋势,10h时明显低于正常水平且达到最低值,随后逐步回升,但直到24 h仍未回到正常水平。让人惊奇的是,ALI中TFPI-2的动态表达模式与TF和TFPI-1明显不同,肺组织中TF/TFPI-2的摩尔比在内毒素处理后2h和6h明显低于对照组,表明此时TFPI-2的表达量明显高于TF;而TF/TFPI-1的摩尔比在内毒素处理后6h、10h和12h明显高于对照组,提示该阶段TF的促凝活性明显强于TFPI-1的抗凝活性。免疫组织化学显示,TF、TFPI-1和TFPI-2均定位于肺泡壁。根据以上的实验结果,我们认为TFPI-2在ALI的发生发展中可能发挥了重要作用。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R563
【部分图文】：

运用pICgK一TFpl一2为模板，用sense和Antisense引物PeR扩增TFPx一2编码序列，并引入EeoRI和sall两个酶切位点，获得PeR产物EeoRI一TFpl一2一SalI，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1一4)后纯化回收产物片断，回收产物与经过相同酶切、凝胶电泳及纯化回收的质粒载体片断sall一pGBKT7一EcoRI连接后转化大肠杆菌，抗生素加压筛选转化子;挑取克隆作模板以 T7Promote:Primer和TFPI一 2Antisense为引物作PCR，其PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1一5)，阳性克隆会PCR扩增出产物T7一TFPI一2一Sall;扩增阳性克隆菌并抽提质粒，酶切质粒做凝胶鉴定(图1一6)和测序鉴定(图1一7)，确保pGBKT7/TFPI一2质粒成功构建。仪协令3刃令图1一4.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物EcoRI一TFPI一2一Sall F191一4.Identi们 cationofPCRProductionEcoRI·TFPI·2· Sal1inl%agar gel.M:DNAmarker;1一 10:PCRProduetionEeoRI一TFPI一2一Sall(662bP).

匕 yEeoRI、今今今撇7kh瀚4kh图1一6.质粒的酶切鉴定Figl一6.ldenti们 cationofBaitvectorbyenzymecleavage.

哎2匡E二兮刁一乞.工OAa一0，一妇.一。比Timepe蛇LPS《h) TimePO幼LPS(h】图2一6生理盐水或LPS处理后不同时间点小鼠肺组织中IL一lp和TNF一Q的加RNA水平FigZ· 6.mRNAlevelofIL一 lpandTNF· ainlungtissueatdifferenttimePointsa代 erLPSorsaline(Ctrl)treatmentbyRealtimePCR.Relative quantitiesofIL一 lp(A)andTNF一 a(B)atmRNAlevelwereexPressedasthe ratioofmRNAIeveloftargetgenetothatofp一 aetin.10mieewereexaminedin eaehgrouP， andresultswerePlottedasmeans土SE，*，P<0.05;**，P<0.01 VersusCtrl. A2500日 502500750哎之生‘左兮﹂1节15，a比一铭不缪2000 15001000500V圣‘钾改认1节兰.乙-Ja^泥t比 Ctd126101224 T.mePO时L
【共引文献】

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本文编号：2893709