胸水p16基因纯合性缺失的检测及其临床意义

发布时间：2020-12-24 16:04

　　目的 建立多肿瘤抑制基因（MTS1或p16基因）纯合性缺失分析方法，探讨胸水p16基因纯合性缺失检测的临床意义。方法 本研究以人Hela细胞mRNA为模板，经RT-PCR获得p16第二外显子cDNA，插入质粒pGEM-T中，然后转化E.coliXL1-blue，经限制性内切酶酶切图谱分析，并以美国冷泉港实验室提供的p16基因第二外显子cDNA为探针证实我们所构建的重组质粒含p16基因第二外显子。此重组质粒经扩大培养、质粒纯化、EcoR1酶切、酶切DNA片段纯化获得p16基因第二外显子cDNA作为DNA探针；用地高辛标记法标记p16cDNA探针。再根据已发表的p16基因序列，设计p16基因第一、第二外显子和CDK4引物，以CDK4为内参照，经PCR获得特异扩增产物，无p16基因的PCR产物而出现CDK4扩增产物者为p16基因第一、第二外显子纯合性缺失。结果21例结核性胸水无一例存在p16基因纯合性缺失，31例癌性胸水中均未出现p16基因第一外显子纯合性缺失，但发现有12例存在p16基因第二外显子纯合性缺失，阳性率为38.7％（12/31）。同时也作了胸水细胞学检测，16例胸水细胞学阳性，... 

【文章来源】：安徽医科大学安徽省

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

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前言
1 材料与方法
    1.1 Hela细胞培养
    1.2 Hela细胞总RNA的制备（异硫氰酸法）
    1.3 mRNA的制备（oligo（dT）层析法）
    1.4 cDNA第一链的合成以及RT-PCR
    1.5 p16第二外显子cDNA PCR产物的纯化
    1.6 pGEMT质粒与p16第二外显子cDNA连接
    1.7 感受态细胞的制备和转化
    1.8 质粒提取及定量
    1.9 阳性克隆鉴定
        1.9.1 重组质粒DNA酶切图谱分析
        1.9.2 DNA序列分析
    1.10 p16基因第二外显子cDNA的制备及纯化
    1.11 p16基因第二外显子cDNA探针的标记
    1.12 p16基因第二外显子Southern Blotting方法的建立
    1.13 胸水DNA的制备
    1.14 多肿瘤抑制基因（MTS）基因纯合性缺失PCR分析方法的建立
2 结果
    2.1 pGEM-p16克隆的构建及其p16基因第二外显子纯合性缺失PCR分析方法的建立
        2.1.1 pGEM-p16重组质粒的限制性内切酶酶切图谱分析
        2.1.2 DNA序列分析
        2.1.3 p16基因第二外显子cDNA的制备
        2.1.4 Southern blot结果
        2.1.5 p16基因第二外显子纯合性缺失PCR分析方法的建立
    2.2 临床胸水标本p16、p15基因纯合性缺失的分析
        2.2.1 癌性胸水中多肿瘤抑制基因（p16、p15）基因纯合性缺失率
        2.2.2 多肿瘤抑制基因（p16、p15）基因纯合性缺失和其他确诊方法
        2.2.3 31例癌性胸水p16基因第二外显子纯合性缺失情况
3 讨论
    3.1 pGEM-p16克隆的构建及其p16基因第二外显子纯合性缺失PCR分析方法的建立
        3.1.1 pGEM-p16克隆的构建
        3.1.2 p16基因第二外显子纯合性缺失PCR分析方法的建立
    3.2 p16基因的作用及其在肺癌、癌性胸水中的研究意义
        3.2.1 p16基因在细胞周期中作用
        3.2.2 p16基因研究在肺癌及癌性胸水中的临床意义
4 结论
参考文献
对本课题的进一步设想
致谢
个人简历
在学期间的研究成果目录
综述-p16基因与肺癌关系的研究进展
    1 p16基因在细胞周期中的作用
    2 p16基因异常与肺癌的发生和发展
        2.1 p16基因缺失与肺癌
        2.2 p16基因点突变与肺癌
        2.3 p16基因甲基化与肺癌
    3 p16基因与肺癌基因治疗研究
    4 p16的临床研究进展
    5 结语
    参考文献


【参考文献】：
期刊论文
[1]重视胸膜疾病的诊治和研究[J]. 谢灿茂.  中华结核和呼吸杂志. 2001(01)
[2]聚合酶链反应分析多肿瘤抑癌基因1第二外显子纯合性缺失[J]. 刘虎,桂淑玉,汪渊,周青.  安徽医科大学学报. 2000(03)
[3]抑癌基因在肺癌治疗中的新进展[J]. 吴文青,范希光,饶纬华.  中华结核和呼吸杂志. 1999(11)
[4]肺癌P16基因纯合缺失、突变、表达及临床意义[J]. 冉瑞琼,曹晓运,涂宣林,傅晓颖,宋后燕,曹世龙.  中国癌症杂志. 1998(03)
[5]胸水癌胚抗原与铁蛋白检测对恶性胸水的参考价值[J]. 李静,梅昆.  中华结核和呼吸杂志. 1994(03)



本文编号：2935938